Para começar, coloque o chip e o portador de chips no suporte de chips localizado em uma placa de cultura de tecido estéril e mantenha-o de lado no capuz de cultura de tecidos enquanto prepara o reagente de ativação de chip. Adicione um mililitro da solução de CR2 ao frasco para injetáveis contendo pó de CR1. Transfira a solução do frasco para injetáveis para um tubo de 15 mililitros envolto em papel alumínio.
Repita este processo até que quatro enxaguamentos e quatro mililitros de CR2 tenham sido lavados através do frasco para injetáveis de CR1. Para o último enxágue, tampe o frasco para injetáveis e inverta-o para remover o pó residual. Em seguida, adicione seis mililitros de CR2 ao tubo de 15 mililitros contendo CR1.
Misture a solução final de 10 mililitros com uma pipeta sem introduzir bolhas. Usando uma ponteira de pipeta de 200 microlitros, adicione 20 microlitros de solução CR1 à entrada do canal inferior do chip até que a solução comece a sair da saída do canal inferior. Adicione 50 microlitros de solução CR1 através da entrada do canal superior até que a solução comece a sair da saída do canal superior.
Em seguida, coloque os chips sob luz ultravioleta por 15 minutos. Após a exposição, remova qualquer solução CR1 dos canais superior e inferior. Lave ambos os canais com 100 microlitros de solução CR2.
Em seguida, lave duas vezes com 100 microlitros de DPBS. Prepare as soluções de matriz extracelular para os canais superior e inferior do chip. Adicione 50 microlitros de solução de matriz extracelular à entrada do canal inferior até que a gota apareça na saída.
Em seguida, adicione 50 microlitros à entrada do canal superior até que a gota apareça na entrada. Adicione DPBS ao reservatório do suporte do chip. Coloque a tampa na placa e incube os cavacos durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono na incubadora.
No dia seguinte, lave o canal epitelial ou superior do chip com 100 microlitros de mídia de expansão de chip pré-aquecido. Em seguida, lave o canal endotelial ou inferior com 100 microlitros de meio HIMEC pré-aquecido. Após a contagem, adicionar 10 microlitros de HIMECs ao canal endotelial.
Se necessário, adicione meios de crescimento organoides ou meios de expansão de cavacos ao canal epitelial e verifique a densidade de semeadura dos HIMECs. Em seguida, inverta o chip no suporte de chip colocado no prato de cultura celular, adicione DPBS ao reservatório no berço do chip e coloque o chip a 37 graus Celsius por duas a três horas para permitir que os HIMECs se conectem à membrana do chip. Após a incubação, retorne o berço do cavaco para uma posição vertical.
Lavar suavemente o canal endotelial com 100 microlitros de meio HIMEC aquecido e o canal epitelial com meios de crescimento organoide ou meio de expansão de chips, deixando o meio no canal. Para a colheita dos enteróides, aspirar suavemente o meio e lavar os poços contendo hidrogel de matriz de cultura celular com 500 microlitros de DPBS quente. Adicione 250 microlitros de solução de recuperação de células frias a cada poço e risque o fundo de cada poço com uma ponta de pipeta fresca para interromper o hidrogel de matriz de cultura celular.
Adicione a suspensão de células interrompidas a um tubo frio de 15 mililitros sobre gelo e incube por 45 minutos. Após a incubação, centrifugar a suspensão e retirar o sobrenadante. Em seguida, adicione dois mililitros de meio de dissociação enteróide morno ao pellet e coloque o tubo em banho-maria a 37 graus Celsius.
Por 60 a 120 segundos, em seguida, adicione 10 mililitros de lenço de papel frio ao tubo. Em seguida, centrifugar e remover o sobrenadante antes de ressuspender o pellet em 200 microlitros de meio de expansão de cavacos. Usando uma pipeta P200, dissociar os enteróides e adicionar a suspensão em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.
Conte as células e ajuste o volume do meio de expansão do chip para atingir uma concentração de seis vezes 10 a seis células por mililitro. Em seguida, adicione 30 microlitros de suspensão de célula ressuspensa ao canal superior do chip. Depois de devolver os cavacos ao berço de chips, adicione DPBS ao reservatório e incube os chips durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.
No dia seguinte, lavar o canal epitelial duas vezes com 100 microlitros de chip de meio de expansão e o canal endotelial com 100 microlitros de meio HIMEC. Em seguida, adicione dois mililitros do meio de expansão do chip ao reservatório de entrada do canal superior e 300 microlitros ao reservatório de saída do canal superior. Adicione dois mililitros do meio HIMEC ao reservatório de entrada do canal inferior e 300 microlitros ao reservatório de saída do canal inferior.
Prima as vagens e adicione as fichas às vagens. Em seguida, adicione os pods ao módulo de cultura. Defina uma vazão de 30 microlitros por hora e inicie o ciclo.
As células epiteliais intestinais cultivadas usando o intestino neonatal em um chip formaram uma monocamada de células confluentes e, posteriormente, desenvolveram-se em estruturas tridimensionais maduras semelhantes a vilosidades. A adição de um microbioma disbiótico de um neonato com enterocolite necrosante grave ao intestino neonatal em um modelo de chip mostrou expressão aumentada de TNF-alfa em comparação com o controle.
