Comece inoculando uma única colônia bacteriana em 200 mililitros de caldo Luria esterilizado em um frasco Erlenmeyer de 500 mililitros. Cultive as bactérias durante a noite em uma incubadora de agitadores a 37 graus. Após 14 horas de cultivo, verificar a densidade óptica das bactérias a 600 nanômetros.
Aliquot as bactérias em tubos cônicos de 50 mililitros e armazená-los a quatro graus Celsius para uso posterior. Usando uma pipeta sorológica, transfira 50 mililitros da cultura bacteriana para um novo frasco de Erlenmeyer de 250 mililitros rotulado para controle vivo ou simulado. Use uma pipeta sorológica para transferir 50 mililitros da bactéria para um tubo cônico de 50 mililitros para o controle simulado antes da lavagem.
Na coifa química, adicione 781 microlitros de paraformaldeído à cultura bacteriana para atingir uma concentração final de 0,5%Descarte a ponta usada em um recipiente de risco químico de resíduos sólidos. Em seguida, cubra o balão com uma folha de papel alumínio e coloque-o em uma incubadora a 37 graus Celsius por uma hora. Quando a incubação estiver completa, lave as bactérias para remover qualquer paraformaldeído residual.
Para a remoção do paraformaldeído residual, utilizando uma pipeta sorológica, transferir as bactérias tratadas do frasco de Erlenmeyer para um tubo cônico de 50 mililitros. Em seguida, centrifugar as bactérias tratadas a aproximadamente 3000 G por 20 minutos. Descarte o sobrenadante em um recipiente de risco químico de resíduos líquidos dentro da coifa química.
Agora adicione 25 mililitros do caldo Luria aos pellets bacterianos tratados e de controle, e vortex para ressuspender os pellets bacterianos. Repita a centrifugação e a ressuspensão do pellet quatro vezes. Em preparação para vários ensaios, ressuspenda o pellet em volumes adequados.
Para ensaios de vida útil. Seme 200 microlitros de bactérias ressuspendidos em 10 mililitros de caldo Luria em placas de 60 milímetros. Armazenar as bactérias a quatro graus Celsius.
Para realizar uma verificação de qualidade do crescimento bacteriano, passe uma placa de caldo Luria com uma bactéria preparada usando uma ponta de pipeta estéril. Para verificar a contaminação, bife o caldo Luria usado para lavar e ressuspender em um prato separado. Em seguida, coloque as placas em uma incubadora de 37 graus Celsius durante a noite.
No dia seguinte, verifique se há algum crescimento bacteriano. Salve as bactérias se a preparação de aldeídos paraformes for bem-sucedida e as colônias não crescerem na placa LB. Para verificar a atividade metabólica bacteriana com um respirômetro, primeiro hidrate o cartucho adicionando 200 microlitros de calibrador a todos os poços em uma placa de 96 poços.
Coloque o cartucho na placa de 96 poços e incube durante a noite a 37 graus Celsius. Configure a máquina para misturar, pesar, medir e fazer loop. No dia seguinte, coloque o cartucho hidratado na máquina.
Para uma nova placa de 96 poços, adicione 160 microlitros de M9 aos poços de teste, seguidos por 40 microlitros de bactérias preparadas. Adicione 200 microlitros de M9 nos quatro poços de canto para agir como brancos. Dispensar 160 microlitros de M9 e 40 microlitros de caldo Luria como controles negativos.
Finalmente, pipetar 200 microlitros de M9 para os poços restantes não utilizados. Em seguida, substitua a placa de calibração ejetada pela placa de ensaio antes de executar o programa. Os resultados serão exibidos como a taxa de consumo de oxigênio.
Diferentes cepas exibiram diferentes tempos de resposta de inativação ao paraformaldeído. Por exemplo, a exposição da bactéria HB101 a 0,25% por uma hora é suficiente para torná-la metabolicamente inativa. Enterococcus faecalis necessitou de uma concentração de 1,0% para um efeito consistente.
Os vermes Caenorhabditis elegans exibiram preferências semelhantes em relação às cepas OP 50 tratadas, bem como ao controle tratado simuladamente. No entanto, um ensaio pareado sensível revelou uma preferência mais forte pelo controle tratado simulado. Vermes no OP 50 tratado têm uma taxa de bombeamento mais alta do que os vermes no controle tratado simulado.
O consumo de bactérias tratadas resultou em atraso no tempo de desenvolvimento de vermes selvagens, bem como em menor capacidade de postura de ovos. O tempo de vida dos vermes não foi significativamente diferente entre si, independentemente da fonte de alimento. No entanto, as bactérias tratadas com paraformaldeído aumentaram a vida útil do verme na presença de 5-Fluoro-2'desoxiuridina O consumo das bactérias tratadas com paraformaldeído por uma cepa de verme de vida longa não alterou sua longevidade.
