Comece tripsinizando as células-tronco mesenquimais humanas para criar uma suspensão celular. Em seguida, aliquote a suspensão da célula em um tubo de 1,5 mililitro para criar 10 construções. Depois de centrifugar a suspensão a 220g por três minutos, use uma bomba de vácuo para remover o sobrenadante.
Agora, coloque a pelota de célula no gelo. Em seguida, leve o ácido hialurônico modificado por tiol, o reticulante tiol-reativo, o diacrilato de polietilenoglicol e as garrafas de água desgaseificada à temperatura ambiente. Em condições estéreis, use uma seringa equipada com agulha para adicionar um mililitro de água desgaseificada ao frasco contendo ácido hialurônico.
Vórtice a solução, ocasionalmente aquecendo-a a 37 graus Celsius até que fique clara. Em seguida, coloque a solução no gelo. Em condições estéreis, adicione 5 mililitros de água desgaseificada ao frasco reticulante.
Dissolva invertendo repetidamente antes de colocá-lo no gelo. Agora, adicione 120 microlitros da solução de ácido hialurônico dissolvido ao pellet de célula aliquotada e ressuspenda o pellet de célula pipetando a solução para frente e para trás. Adicione 30 microlitros da solução de reticulante dissolvido no tubo com o pellet de célula ressuspendido.
Garanta a mistura adequada tocando no tubo. Após a mistura, gire brevemente a solução. Solte 15 microlitros da solução combinada em uma placa de 24 poços revestida com parafina.
Deixe solidificar a 37 graus Celsius por 30 minutos. Para a diferenciação in vitro, adicionar 0,5 mililitros de meio de diferenciação condrogênica aos hidrogéis assentados na célula. Após três semanas, mudar para o meio de diferenciação hipertrófica, adicionando 0,5 mililitros por poço.
A diferenciação condrogênica resultou em glicosaminoglicanos sulfatados na matriz extracelular positiva para colágeno tipo 2, tanto no ácido hialurônico ou no AH, quanto no colágeno. Entretanto, a distribuição foi mais homogênea nas construções do ácido hialurônico. As construções colágenas demonstraram células periféricas com morfologia heterogênea.
A arredondamento média das células nos construtos de AH foi maior do que nos construtos de colágeno. Deposição de cálcio foi detectada nas bordas externas de ambos os construtos em cinco semanas. Nas construções in vivo do AH, todos os implantes foram fixados uns aos outros em bolsas subcutâneas e formaram tecido ósseo integrado.
40% das construções de colágeno in vivo foram independentes. Tecido osteóide com morfologia lamelar foi formado nas regiões externas de ambos os construtos in vivo oito semanas após o implante. Perda de cartilagem também foi observada no construto do AH.
Múltiplas construções in vivo de AH parecem formar tecido ósseo integrado, como indicado pela conexão com os tecidos ósseos e pela presença de tecido fibroso articular. Enquanto 40% dos construtos de colágeno estavam unidos, os demais construtos existiam separados ou estavam apenas aderidos sem conexões de tecido ósseo. Ambos os construtos mostraram vasos marcados positivamente na medula óssea, e a cartilagem interna estava circundada por células osteoclásticas multinucleadas.
O mineral foi depositado na região externa do osteóide de ambos os constructos com maior volume mineral e construções de AH devido ao seu maior tamanho.
