Comece extraindo o DNA genômico das folhas de bambu do tipo selvagem e infectadas por Agrobacterium. Amplificar o DNA genômico contendo o sítio alvo dos genes-alvo de folhas de bambu selvagens e infectadas por Agrobacterium usando as seguintes condições de PCR. Após a PCR, realizar a digestão da enzima endonuclease preparando uma mistura de reação contendo um microlitro de idade-1, um micrograma de produtos de PCR e um tampão 10X de cinco microlitros.
Em seguida, adicione água a um volume final de 50 microlitros. Incubar a mistura de digestão a 37 graus Celsius por uma hora. Usando eletroforese em gel, analise a proporção de fragmentos de DNA digeridos.
Compare os fragmentos digeridos das amostras selvagens e infectadas por Agrobacterium para avaliar a eficiência da edição de genes. Expor as mudas de bambu a condições de alta intensidade luminosa para aumentar a quantidade de luz absorvida quântica e ativação do sistema de fotoproteção foliar. Em seguida, ligue o fluorômetro IMAGING-PAM e ajuste a intensidade da luz actínica para medir in vivo a fluorescência da clorofila do fotossistema II das folhas de bambu.
A coloração vermelha da faixa beta produzida pelo gene RUBY indicou sucesso na expressão gênica mediada por Agrobacterium em folhas de bambu. Das quatro cepas de Agrobacterium, a cepa GV3101 causou o acúmulo mais significativo de beta lane em folhas de bambu infectadas. Após a infecção com os construtos CRISPR-Cas9 e tratamentos com alta luminosidade, determinadas áreas das lâminas foliares apresentaram menores valores de têmpera não fotoquímica.
Além disso, a digestão enzimática e a análise de sequenciamento confirmaram a mutação bem-sucedida do gene PeVDE nas regiões editadas. Os resultados do sequenciamento de Sanger do fragmento PeVDE após edição por sgRNA1 e sgRNA2 mostraram deleção de um fragmento longo no gene PeVDE. Após 30 dias da infecção por Agrobacterium, as áreas foliares transfectadas com sgRNAs para PeVDE e PeCCR5 exibiram menores valores de têmpera não fotoquímica.
