Para começar, coloque as amostras de coágulo de sangue cerebral coletadas em um prato limpo usando uma pinça. Em seguida, usando uma pipeta, adicione cinco mililitros de soro fisiológico e agite suavemente o prato. Retire o soro fisiológico usando uma pipeta.
Usando uma tesoura, pique os coágulos em pequenos pedaços. Mais uma vez, adicione cinco mililitros de soro fisiológico aos coágulos e agite o prato suavemente antes de aspirar o soro fisiológico com uma pipeta. Em seguida, usando pinças, transfira os pedaços de coágulos para uma nova placa em U limpa.
Prepare a solução de trabalho SFE ajustando a concentração de SFE para 2.000 unidades por mililitro usando soro fisiológico. Adicione 300 microlitros da solução de trabalho SFE aos coágulos pré-tratados. Para iniciar a primeira rodada de degradação, incube a mistura de SFE e coágulos a 37 graus Celsius por meia hora.
Depois disso, agite suavemente para misturar a amostra tratada com SFE. E usando uma pipeta limpa, transfira a porção líquida para um tubo estéril. Separe o coágulo restante para mais uma rodada de degradação.
Centrifugar o líquido recolhido a 200 G durante cinco minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, usando uma pipeta, transfira o sobrenadante ou a solução SFE recuperada para outro tubo limpo. Ressuspender o pellet celular resultante em 50 microlitros de soro fisiológico por mistura suave.
Depois disso, execute rodadas subsequentes de degradação nos coágulos restantes usando a solução SFE recuperada, conforme demonstrado anteriormente. Reúna a mistura celular de cada rodada de degradação para preparar a amostra de células sanguíneas. Adicionar cinco microlitros da amostra celular obtida à lâmina de vidro revestida com poli-L-lisina.
E usando uma tampa, lambuze as células. Deixe o líquido evaporar à temperatura ambiente. Para realizar a coloração celular, adicione suavemente 100 microlitros de corante direito ao esfregaço celular.
Deixe as células mancharem por 30 minutos à temperatura ambiente antes de enxaguar suavemente o corante com água limpa. Finalmente, examine as células coradas usando um microscópio de luz. Coágulos sanguíneos vermelhos compactos com uma solução de trabalho incolor foram observados durante o estágio inicial de degradação.
A dissolução do coágulo foi observada após 30 minutos de incubação e uma incubação prolongada de até cinco horas dissolveu a maioria dos coágulos, enquanto não houve mudança significativa no grupo controle negativo, mesmo após 10 horas de incubação. Após uma coloração direita, hemácias maduras, plaquetas e vários granulócitos foram claramente identificáveis sob um microscópio de luz. Os componentes celulares puderam ser analisados quantitativamente com o auxílio da auto-hematologia com sucesso.
