Para começar, coloque os pedaços de amostras de placenta em PBS. Descarte a placa coriônica, a decídua materna e quaisquer infartos visíveis do espécime. Dissecar o espécime de tecido remanescente em explantes vilosos com um diâmetro transversal de cerca de 0,5 centímetros.
Transfira os explantes para uma placa de Petri recheada com PBS fresco. Com um par de pinças, agite cada explante no PBS para remover todo o sangue. Sob um exaustor estéril, use fechaduras luer para conectar cinco câmaras ao frasco reservatório.
Inverta as câmaras de cabeça para baixo e retire o fundo. Agora use pinças para colocar as placas de metal centralmente nas partes superiores das câmaras com os pinos apontando para cima. Encha metade das câmaras com um mililitro de meio de cultura pré-aquecido.
Adicione mais 20 mililitros do meio no reservatório. Com pinças, coloque cuidadosamente o explante viloso sobre as agulhas da placa de metal na câmara. Coloque quatro explantes em uma única câmara.
Reconecte o fundo das câmaras para fechá-lo. Em seguida, conecte a tubulação da bomba à bomba para conectar o circuito de fluxo com a bomba peristáltica dentro do biorreator. Corrija-o no quarto estágio.
No menu Bombas, escolha o modo Manual. Ajuste a velocidade da bomba para um mililitro por minuto e clique em Executar para iniciar o bombeamento. Segure as câmaras em um ângulo durante o enchimento para garantir o enchimento completo.
Quando o processo de enchimento terminar, inverta a câmara novamente. Confirme se as câmaras estão seguras e feche ambas as tampas do biorreator. Quando a incubação do tecido estiver concluída, clique em Abortar para parar a bomba.
De cada vez, abra duas tampas do biorreator e uma câmara de fluxo. Use pinças para remover cuidadosamente os explantes da placa de metal para análise posterior. Os explantes corados imunohistoquimicamente mostraram uma apresentação visual bem estruturada e organizada do citoesqueleto em tecido de cultura fresco e fluxo.
Ao longo do tempo, a agregação de microfilamentos foi cada vez mais observada em explantes estáticos, significando uma degradação da estrutura do citoesqueleto. A diminuição da integridade tecidual ao longo do tempo de cultivo foi confirmada pela indicação de hematoxilina e eosina. Os tecidos frescos mostraram um estroma denso e bem compactado.
Após 48 horas de cultura em fluxo, foram observados fragmentos parcialmente destacados do sinciciotrofoblasto. A integridade tecidual foi preservada inadequadamente já após 24 horas em condição de cultura estática, que se deteriorou ainda mais após 48 horas. A coloração de células endoteliais mostrou células distintamente organizadas no tecido fresco.
A integridade morfológica foi amplamente mantida mesmo após 48 horas nas culturas de fluxo. O explante estático, no entanto, exibiu colapso parcial mesmo após 24 horas, que se deteriorou ainda mais após 48 horas.
