Coloque o GCaMP 5G expressando retina de rato montado no MEA com o GCL voltado para os eletrodos no estágio do microscópio. Conectar o sistema de perfusão e ajustar os parâmetros para perfundir constantemente o banho da amostra com o meio AMS oxigenado. Em seguida, inspecione a retina usando um microscópio de fluorescência invertida equipado com uma lâmpada fluorescente, um filtro FITC e uma câmera CMOS.
Procure uma área onde os eletrodos estimuladores e a fluorescência das células que expressam GCaMP são visíveis. No software dos dispositivos geradores de pulsos, configure os parâmetros de estimulação elétrica como forma, amplitude, duração, atraso de fase e frequência dos pulsos para aplicação. Conecte a câmera ao gerador de pulsos usando o sinal de gatilho de saída e defina o modo de captura do software da câmera para o gatilho de início externo.
Pressione o botão Iniciar no software da câmera para que ele aguarde um gatilho externo para iniciar. Inicie o processo de aquisição de imagens usando o software gerador de pulsos e salve as imagens capturadas, garantindo que o nome do arquivo inclua todos os parâmetros de estimulação elétrica aplicados. Agora abra a imagem J e segmente a região de interesse usando as ferramentas de seleção de área, adicione-a ao gerenciador de ROI e salve-a como uma pasta zip usando o menu do gerenciador de ROI.
Extraia o valor médio de cinza dos somas da célula navegando para mais e clicando em multimedida. Habilite as opções de medir todas as 600 fatias e uma linha por fatia para obter uma única tabela na qual as colunas correspondem a ROIs e as linhas correspondem a períodos de tempo. Em seguida, extraia o centroide das ROIs usando o comando measure.
Para corrigir o efeito de clareamento fotográfico e minimizar o plano de fundo, selecione aproximadamente 15 a 20 quadros dos intervalos não estimulantes antes de cada explosão e ajuste esses quadros a uma curva linear para garantir a análise de dados ideal. Os traços de cálcio de somas celulares em cinco rajadas de trens de pulso a cada 10 segundos durante uma aquisição de imagem de 60 segundos são mostrados. Molduras dos períodos não estimulantes são usadas para corrigir o efeito de clareamento fotográfico.
A relação entre a corrente necessária para ativar as células e a distância do eletrodo estimulador mostrou que as células localizadas mais próximas ao eletrodo estimulador necessitaram de valores de corrente mais baixos para evocar uma resposta.
