Comece adicionando dois mililitros de células MCF-7 contendo diferentes drogas nos poços de uma placa de seis poços. Incubar as culturas celulares durante 24 horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Colher as células por centrifugação a 560 x g durante três minutos a quatro graus Celsius.
Em seguida, lave as células duas vezes com PBS pré-resfriado, centrifugando a 560 x g por três minutos entre as lavagens. Adicionar 50 microlitros de tampão de lise às células lavadas e colocar a amostra em banho de gelo por 15 minutos. Em seguida, centrifugar a amostra a 8, 550 x g por 10 minutos a quatro graus Celsius, e coletar a amostra de proteína sobrenadante.
Combinar a amostra de proteína com o tampão de carga numa proporção de quatro para um. Em seguida, desnature a mistura a 100 graus Celsius por 10 minutos em um banho de metal. Em seguida, resfriar a mistura em temperatura ambiente.
Separe a amostra de proteína usando eletroforese em gel de poliacrilamida SDS a 10%. Transfira as proteínas para uma membrana PVDF de 0,22 micrômetro. Depois de bloquear a membrana com 5% de BSA, incubá-la com os anticorpos primários correspondentes durante a noite a quatro graus Celsius.
No dia seguinte, incubar a membrana com anticorpo secundário IgG de cabra anti-coelho a 37 graus Celsius por duas horas. Em seguida, desenvolva as membranas usando uma solução de quimioluminescência ECL e capture as imagens usando um sistema de imagem Western blot quantitativo sem contato. O tratamento com salidrósido promoveu a expressão proteica dos fatores pró-apoptóticos CC-9, CC-7, CC-3, Bim e Bax enquanto inibiu a expressão proteica do antiapoptótico BCL-2.
O salidrosídeo limitou proeminentemente as proporções de p-PI3K para PI3K e p-AKT para AKT. Enquanto isso, a expressão proteica de mTOR, HIF-1 alfa e Fox01 também foi notavelmente suprimida.
