Colher as células MCF-7 por centrifugação a 560-G por três minutos, a quatro graus Celsius. Adicione 500 microlitros de RL-1 tamponada a cinco vezes 10 às seis células e misture bem até que nenhuma massa celular seja visível. Em seguida, transfira os homogeneizados celulares para uma coluna de limpeza de DNA embutida no tubo de coleta.
Centrifugar as amostras a 85-50-G por dois minutos, a quatro graus Celsius. Após a centrifugação, remova a coluna de limpeza do DNA, retendo o sobrenadante no tubo de coleta. Adicione 800 microlitros de tampão RL-2 e 500 microlitros do sobrenadante e misture delicadamente.
Em seguida, transfira 700 microlitros da mistura para uma coluna somente de RNA embutida no tubo de coleta. Centrifugar o tubo a 8, 550-G por um minuto, a quatro graus Celsius. Em seguida, descarte o fluxo no tubo de coleta.
Lave a coluna somente de RNA primeiro com 500 mililitros de tampão RW-1 e, em seguida, com 700 mililitros de tampão RW-2, centrifugando por um minuto a 8, 550-G e quatro graus Celsius a cada lavagem. Depois de remover o RW-2 residual por centrifugação novamente, transferir a coluna somente de RNA para um novo tubo de coleta. Adicione 100 microlitros de água deionizada livre de RNAs, pré-aquecida a 65 graus Celsius ao centro da membrana na coluna somente de RNA, e aguarde dois minutos.
Em seguida, centrifugar a 8, 550-G por um minuto, a quatro graus Celsius para coletar a solução de RNA. Configure a mistura de reação para PCR e, em seguida, defina as condições de reação de PCR do sistema. Execute o procedimento de QRT PCR.
A QRT PCR mostrou que o tratamento com cilindricidade promoveu a expressão gênica dos fatores pró-apoptóticos, CC-9, CC-7, CC-3, vim e vax, enquanto inibiu a expressão gênica do antiapoptótico BCL-2. Além disso, a administração de cilindros reduziu os níveis de expressão gênica de PI-3K, AKT, M-tor, HIF1-Alpha e Fox-01.
