Para começar, prepare as quatro folhas de papel filtro, cada uma medindo 12,5 por 7,5 centímetros. Empilhe duas folhas juntas e coloque a pilha no buffer de transferência para mergulhar. Coloque a membrana de PVDF em etanol 95% e agite a membrana em um balancim por um minuto.
Relembre o etanol. Mergulhe a membrana em tampão de transferência. E agite por dois minutos.
Em seguida, coloque a pilha de papel de filtro de molho em uma superfície plana e móvel, como uma tampa grande e achate-a usando um rolo. Usando um liberador de gel ou pinça, posicione cuidadosamente a membrana de PVDF na pilha. Depois, coloque uma única folha de papel de filtro seco sobre essa membrana e deslize o rolo sobre o papel para absorver qualquer excesso de tampão que esteja na superfície da membrana.
Retire o papel de filtro superior sem esfregar contra a membrana. Retirar amostras de fibras isoladas do congelador e descongelá-las à temperatura ambiente antes de centrifugar e ressuspender completamente a amostra. Coloque uma gota de um microlitro de cada amostra no centro da área de membrana designada.
Evite tocar a membrana com a ponta da pipeta. Deixe que as gotículas da amostra absorvam totalmente na membrana por 15 minutos. Em seguida, usando um liberador de gel ou uma pinça, levante cuidadosamente a membrana da pilha de papel de filtro úmido.
Coloque em uma folha seca de papel filtro e deixe por pelo menos cinco minutos para desidratar. Reative a membrana depois que os pontos da amostra ficarem completamente brancos. Em seguida, prossiga com a imunomarcação da proteína-alvo.
Saiba como usar a intensidade do painel de sinais para classificar a intensidade das isoformas MHC e dos sinais de Actina das imagens dot blot. A detecção de proteínas alvo fortes, médias e pequenas é mostrada por sinais saturados, moderados e fracos, respectivamente. Para identificação do tipo de fibra, inicialmente comparar os resultados da miosina de cadeia pesada IIA e miosina de cadeia pesada um.
Documente as fibras que exibem apenas uma única isoforma de cadeia pesada de miosina com intensidade de sinal saturada ou moderada. Registrar as fibras detectadas com Actina e não detectar miosina de cadeia pesada um ou IIA como potencial tipo 2X. Se um sinal fraco de isoforma de cadeia pesada de miosina estiver presente com um sinal de actina dessaturada moderado, registre-o como não identificado.
Descarte amostras com proteínas-alvo fracas ou não detectadas. Fibras que apresentem sinais saturados ou moderados de MHCIIA e MHC1 não devem ser usadas para preparação específica do tipo de fibra. Após a identificação do MYO1D, preparar amostras do tipo um e dois combinando fibras com sinais saturados ou moderados para a respectiva isoforma MHC.
Use 10 microlitros de cada amostra específica do tipo de fibra e separe-os em um gel pré-moldado por página SDS, seguindo as orientações do fabricante. Use um imageador de gel para detectar a isoforma MHC alvo, seguindo o protocolo do fabricante. Comparar a intensidade de sinal de cada isoforma MHC em todas as amostras específicas do tipo de fibra.
A identificação do tipo de fibra é confirmada pela isoforma MHC correta em intensidade de sinal moderada ou saturada. A imunomarcação do dot blot permitiu a identificação de fibras tipo dois, fibras tipo um e potenciais fibras tipo 2X. As amostras específicas do tipo de fibra foram validadas, usando anticorpos específicos para western blotting e miosina de cadeia pesada.
