Comece por fixar um separador magnético ao seu suporte. Conecte uma coluna de seleção ao separador magnético e coloque um filtro de células de 70 mícrons sobre a coluna de seleção. Coloque um tubo de 50 mililitros abaixo da coluna de seleção para coletar o fluxo.
Quando as células cerebrais de camundongos atingirem 80% de confluência, aspirar o meio e enxaguar as células com PBS. Adicionar 0,25% de tripsina para separar as células de aderência e incubar a 37 graus Celsius por cinco minutos. Em seguida, adicione um buffer de parada.
Centrifugar a suspensão celular a 300 G durante cinco minutos e remover o sobrenadante. Para a coloração de anticorpos, ressuspenda de 10 a sete células em 100 microlitros de PBS. Em seguida, adicione 10 microlitros de solução de anticorpos LYVE-1 e misture bem.
Incubar a mistura por 30 minutos no escuro a quatro graus Celsius. Após a incubação, centrifugar as células e descartar o sobrenadante. Em seguida, enxágue as células adicionando um mililitro de PBS e centrifugando a 300 G por cinco minutos.
Para marcação de microesferas ressuspenda novamente o pellet em 100 microlitros de PBS e 20 microlitros de microesferas de microesferas. Faça inchar e incubar por 30 minutos no escuro a quatro graus Celsius. Em seguida, centrifugar a suspensão e lavar o pellet com um mililitro de PBS.
Novamente, centrifugar e ressuspender o pellet em quatro mililitros de PBS para exclusão magnética negativa. Passe a suspensão celular através de um filtro de 70 mícrons para eliminar aglomerações. Prepare a coluna de seleção enxaguando-a com três mililitros de PBS.
Em seguida, adicione a suspensão da célula à coluna de seleção. Lave a coluna com três mililitros de PBS e colete células negativas de LYVE-1 em um tubo de 50 mililitros. Para seleção positiva magnética, pipetar seis mililitros de PBS na coluna de seleção.
Em seguida, lave as células marcadas magneticamente empurrando firmemente o êmbolo para dentro da coluna de seleção para obter LLECs positivos para LYVE-1. Em seguida, centrifugar a suspensão de células positivas e remover o sobrenadante. Placa de 10 a quinta células por centímetro quadrado em frasco T25 com cinco mililitros de meio de cultura.
Manter a cultura substituindo 50% do meio a cada dia alternado. Quando as células atingirem 80% de confluência, desanexe-as como demonstrado anteriormente antes de realizar a passagem celular. A análise por citometria de fluxo revelou que a porcentagem de células positivas para LYVE-1 na passagem dois não foi significativamente diferente da passagem três após MACS, indicando uma pureza maior que 95%A coloração por imunofluorescência confirmou a co-coloração de LYVE-1 com PDPN, VEGFR-3 e PROX1, estabelecendo a identidade de LLECs.
As células positivas para LYVE-1 não expressaram F48 e fator de crescimento derivado de plaquetas beta, distinguindo efetivamente LLECs de macrófagos e fibroblastos. As células leptomeníngeas antes da MACS exibiram morfologia heterogênea variando de esferas arredondadas a formas de fibras fundidas. No entanto, após a MACS, os LLECs exibiram características endoteliais típicas, como fusos e formas de paralelepípedos.
