Para começar, incube ovos de galinha fertilizados em uma incubadora umidificada a 38 graus Celsius. Agora disseque as peles dorsais de embriões de galinha estágio 30 a 33 em HBSS. Em seguida, incube as peles em solução salina livre de cálcio e magnésio duas vezes com 0,25% EDTA por 15 a 20 minutos.
Separe cuidadosamente o epitélio e o MESENQUIMA usando uma pinça de relojoeiro e mova o material separado para HBSS, colocado no gelo. Colete o mesênquima separado em um tubo de centrífuga de 15 mililitros e adicione dois mililitros de tripsina de colagenase a 0,1% feita em PBS. Em seguida, incube a solução em banho-maria.
Em seguida, use uma pipeta pasteur para dispersar o mesênquima da pele em uma única suspensão celular. Em seguida, adicione oito mililitros de DMEM contendo 10% de soro bovino fetal para interromper a digestão. Centrifugue as células a 233G por cinco minutos.
Em seguida, ressuspenda o pellet em meio de cultura. Em seguida, coloque uma inserção de cultura de células em um poço de seis poços, coloque uma gota de 10 microlitros das células mesenquimais na inserção. No poço fora da inserção, pipete dois mililitros de DMEM com soro bovino fetal 10%.
Incube as células revestidas a 37 graus em uma incubadora com 5% de dióxido de carbono e 95% de ar por uma hora. Usando uma pipeta de um mililitro, transfira o epitélio intacto para cima da gota mesenquimal plaqueada. Achate o epitélio intacto sobre o mesênquima para formar o explante cutâneo reconstituído.
Deixe uma fina camada de meio na inserção para manter o explante da pele semi molhado. Fornecendo uma interface ar/líquido, incube o explante de pele reconstituída a 37 graus em uma incubadora com 5% de dióxido de carbono e 95% de ambiente de ar. As culturas de órgãos ex vivo parecem homogêneas no início, botões de penas curtas formados após dois a três dias em cultura e botões de penas longas formados após quatro a cinco dias em cultura.
