Para começar, prepare um meio de cultura organoide contendo 10 micromolares Y-27632 e 2,5 micromolares CHIR-99021. Depois de revestir o ECM no gut-on-a-chip, desconecte o tubo de saída do microcanal superior, mantendo o tubo de bypass do microcanal superior aberto. Usando um clipe de ligante, fixe a entrada e a saída do microcanal inferior.
Usando uma micropipeta P100, adicione 20 microlitros da suspensão da célula no orifício de saída do microcanal superior. Fixe o tubo de desvio e entrada do microcanal superior usando clipes de aglutinante. Reconecte a tubulação de saída ao orifício de saída do microcanal superior, garantindo que a tubulação permaneça aberta durante todo o processo.
Uma vez feito, fixe gradualmente a tubulação de saída do microcanal superior usando um clipe aglutinante. Em seguida, ao microscópio, verifique se as células estão distribuídas uniformemente por todo o microcanal superior. Coloque o dispositivo gut-on-a-chip e uma incubadora de dióxido de carbono umidificada a 37 graus Celsius.
Conecte a seringa conectada ao microcanal superior do chip a uma bomba de seringa colocada dentro de uma incubadora. Ajuste a taxa de fluxo para 30 microlitros por hora e inicie o fluxo contínuo do meio de assento para o microcanal superior. Durante esse período, deixe o microcanal inferior fixado.
No dia seguinte ao assento, substitua o meio por um meio de cultura organoide contendo apenas A-83-01. Uma vez estabelecida a monocamada para o microcanal superior, inicie o fluxo contínuo do meio de assento para o microcanal inferior. Em seguida, introduzir meio de cultura organoide nos microcanais superior e inferior para iniciar o desenvolvimento da morfogênese tridimensional no chip.
Aumente a taxa de fluxo para 50 microlitros por hora para atingir uma tensão pura de 0,02 dine por centímetro quadrado no design gut-on-a-chip. Usando um biorreator regulado por computador, aplique 10% de deformação cíclica e 0,15 hertz de frequência às células cultivadas em um dispositivo gut-on-a-chip por dois a três dias para estabelecer a morfogênese tridimensional. Após seis a nove dias de fluxo médio, ocasionalmente foi observado agrupamento da morfogênese tridimensional das células epiteliais intestinais caninas em todo o microcanal.
A coloração por imunofluorescência avaliou a estrutura tridimensional de monocamadas derivadas de organoides e estruturas semelhantes a vilosidades em chips microfluídicos. A função de barreira intestinal medida pelo TEER mostrou valores estáveis de TEER no quinto dia de cultura.
