Comece cultivando as amostras de ilhós isoladas de ratos com dieta gordurosa regular ou dieta rica em gordura durante a noite a 37 graus Celsius. Traçar as condições experimentais desejadas para o estudo. Para cada condição experimental, usando uma pipeta, escolher 100 ilhós em uma placa de Petri de seis centímetros contendo dois mililitros de meio ilhó.
Para induzir a mitofagia, trate os ilhós nas placas de Petri apropriadas com dois microlitros de estoque de Valinomicina nano molar 250 nano por três horas. Isole os ilhós e, usando uma pipeta, transfira os ilhós de cada placa de Petri para um tubo de microcentrífuga separado. Em seguida, gire os ilhós a 350 G por um minuto a 10 graus Celsius e, usando uma pipeta, descarte o sobrenadante.
Lavar a amostra obtida duas vezes com um mililitro de PBS. Entre as lavagens, gire a amostra e descarte o sobrenadante conforme demonstrado anteriormente. Para dissociar ilhós em células únicas, adicione 500 microlitros de 0,05% de tripsina pré-aquecida a 37 graus Celsius, a um tubo de amostra.
Pipetar o conteúdo do tubo para cima e para baixo repetidamente até que os ilhós estejam visivelmente dispersos. Adicione imediatamente um mililitro de meio ilhós pré-aquecido para neutralizar a tripsina. Gire as amostras a 500 G por cinco minutos a 10 graus Celsius.
Retire o sobrenadante cuidadosamente sem perturbar o pellet. Em seguida, lave as amostras duas vezes com meio de fluxo de ilhós. As amostras de células estão agora prontas para serem coradas para análise por citometria de fluxo da mitofagia de células beta.
