Proceder à análise por citometria de fluxo da mitofagia de células beta, preparando-se uma única suspensão celular de cerca de 100 ilhotas espelhadoras isoladas, correspondendo a cada condição experimental desejada a ser estudada. Primeiro, ressuspenda as amostras de ilhotas para cada condição em 500 microlitros de meio de fluxo de ilhotas. Adicione 0,25 microlitros de estoque de MtPhagy aos tubos designados para receber o corante MtPhagy.
Da mesma forma, adicione 0,25 microlitros de estoque TMRE e fluozin-3-AM aos respectivos tubos designados. Embrulhe os tubos em papel alumínio e vórtice cada tubo em baixa velocidade por cinco segundos para misturar o conteúdo. Em seguida, incube os tubos a 37 graus Celsius por 30 minutos.
Na metade da incubação, vórtice cada amostra em baixa velocidade por cinco a 10 segundos. Após a incubação, centrifugar os tubos a 350 G por um minuto a 10 graus Celsius. Descarte o sobrenadante.
E ressuspender as amostras em 500 microlitros de meio de fluxo de ilhotas. Adicione DAPI aos tubos de microcentrífuga contendo amostras que requerem tratamento DAPI. Centrifugar novamente e descartar o sobrenadante como demonstrado anteriormente.
Ressuspender novamente o resíduo em 500 microlitros de meio de fluxo de ilhotas. Finalmente, coloque as amostras no gelo e, em seguida, prossiga com a citometria de fluxo. Ajuste as tensões para dispersão direta ou FSC e dispersão lateral ou SSC para garantir que as populações de células estejam no centro do gráfico de dispersão.
Para excluir múltiplos, em uma porta retangular na altura FSC versus largura FSC, seguida de altura SSC versus largura SSC. Ajuste as tensões e a compensação para DAPI para filtrar células beta vivas. Ajuste as portas de fluorescência para cada fluoróforo usado com base na amostra RFD não corada.
Uma vez que os portões são estabelecidos, colete 10.000 eventos por amostra. Células beta com alta utilização de mitofagia foram definidas como fluozina alta MtPhagy alta TMRE baixa população no quadrante três ou Q3. Os níveis basais e de mitofagia induzidos por valinomicina foram caracterizados em ambas as ilhotas RFD e HFD.
