Para avaliar a mitofagia em células beta pancreáticas murinas usando o repórter de mitofagia codificado geneticamente, cultivar ilhotas pancreáticas isoladas de camundongos selvagens e Mt-Keima durante a noite a 37 graus Celsius. No dia seguinte, adicionar 100 ilhotas em uma placa de Petri de seis centímetros contendo dois mililitros de meio ilhota para cada condição experimental utilizada neste protocolo. Em seguida, dissociar os ilhós em células únicas e corar com FluoZin-3-AM e DAPI, como demonstrado anteriormente para a abordagem baseada no corante Mt-Phagy.
Em seguida, proceder com a análise por citometria de fluxo das amostras. Ajuste a dispersão direta ou FSC e as tensões de dispersão lateral ou SSC para obter uma distribuição uniforme de células em um gráfico SSCA versus FSCA. Para selecionar células únicas e excluir múltiplos, adicione uma porta retangular na altura do FSC versus largura do FSC, seguida da altura do SSC versus largura do SSE.
Os multipletos são excluídos devido aos seus valores de sinal de largura mais altos. Em seguida, configure um portão negativo DAPI para excluir células mortas. Depois disso, configure portas positivas para FluoZin-3-AM para filtrar células beta vivas.
Configure um esquema de triângulo usando a amostra positiva de Mt-Keima para identificar populações de células ácidas e neutras. Uma vez estabelecidas as comportas primária e de fluorescência, avalie-se o fluxo mitofágico usando as alterações basais e induzidas pela valinomicina na fluorescência do Mt-Keima.
