Comece descongelando os carregadores de solutos congelados ou pellets de células SLC em banho-maria à temperatura ambiente. Prepare o tampão de solubilização combinando 135 mililitros de tampão de base e três comprimidos de coquetel de inibidor de protease. Uma vez dissolvidos os comprimidos, ressuspenda o pellet no tampão de solubilização.
Em seguida, adicione desaminase e transfira a suspensão para um homogeneizador resfriado a gelo. Homogeneizar a solução movendo o êmbolo para cima e para baixo aproximadamente 20 vezes, mantendo o homogeneizador no gelo. Em seguida, adicione a solução-mãe de detergente à concentração final de 1%.
Transfira a mistura de solubilização para um tubo cônico de 50 mililitros e gire lentamente a quatro graus Celsius. Após uma hora, centrifugar a mistura e recolher o sobrenadante. Equilibre um volume leito de quatro a seis mililitros de resina Strep-Tactin com o tampão de base.
Em seguida, adicione resina equilibrada ao sobrenadante solubilizado e gire por duas horas a quatro graus Celsius. Despeje a solução em uma coluna de fluxo por gravidade e deixe a solução fluir. Lave a resina com 30 vezes o volume da cama do Strep Wash Buffer em três passos iguais.
Em seguida, adicione de três a cinco mililitros de tampão de ilusão e incube por 15 minutos antes de coletar o eluteu. Medir a concentração de proteínas por espectroscopia absorvente UV. Combine as frações de ilusão desejadas e adicione protease 3C.
Gire o tubo lentamente durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte, equilibre de dois a quatro mililitros de volume de leito de resina de afinidade metálica de cobalto com tampão SEC. Adicione a resina de afinidade metálica de cobalto equilibrada à mistura de reação 3C durante a noite e gire a quatro graus Celsius.
Após uma hora, despeje a solução em uma coluna de fluxo por gravidade e colete o fluxo. Concentrar o fluxo através de um filtro centrífugo de corte de 100 quilodaltons, girando a 3000g a quatro graus Celsius. Coluna SEC balanceada baseada em dextran argos com buffer SEC.
Injete a amostra no loop de amostra e execute o programa SEC com uma taxa de fluxo, de modo que a pressão da coluna esteja abaixo das especificações do fabricante da coluna. Usando um coletor de frações, colete frações de 300 microlitros durante toda a execução do SEC. Depois de agrupar as frações de pico, meça a absorbância a 280 nanômetros.
Em seguida, concentre as amostras no volume necessário em um filtro de corte de 100 quilodaltons. A expressão inicial da proteína SLC em pequena escala foi analisada por eletroforese de página SDS. A microscopia de fluorescência de A GFP marcou SLC, confirmou a localização da proteína, específica para a membrana plasmática com acúmulo intracelular significativo.
Proteína química e estruturalmente homogênea produziu um único pico monodisperso A280 durante cromatografia de exclusão de tamanho.
