Para começar, use uma tesoura para cortar um pequeno pedaço de papel de lente e colocá-lo em uma placa de Petri. Em seguida, despeje a formalina que contém o cérebro fixo e a coluna isolada de um camundongo em um funil forrado com papel de filtro. Transfira o cérebro e a coluna para uma placa de Petri vazia.
Use um bisturi para dividir o cérebro em seis partes coronais. Usando pinças, transfira os espécimes cerebrais para metade do papel da lente na placa de Petri. Corte a medula espinhal em três pedaços usando o bisturi e, em seguida, corte o pedaço da coluna sacral na extremidade caudal até que a medula espinhal se torne visível.
Pegue a coluna torácica com a mão não dominante. Pegue a pinça Adson com os dentes bem fechados na mão dominante e empurre suavemente a extremidade para a abertura menor da coluna vertebral com um movimento suave de torção. Em seguida, usando pinças, puxe suavemente a medula espinhal emergente para fora da coluna, coloque o pedaço do cordão na placa de Petri que contém o papel da lente.
Usando um bisturi, divida três pedaços da medula espinhal em pedaços transversais menores. Organize essas peças na mesma metade do papel da lente que contém as peças do cérebro. Dobre o papel da lente para sanduíche os pedaços de tecido e coloque-o em um rotulado.
Transfira o para um frasco de amostra contendo formalina. Após a incubação, transfira o do recipiente da amostra para o primeiro banho de formalina no processador automático de tecidos e execute o processador durante a noite. No dia seguinte, retire os do processador de tecido e transfira-os para a câmara de retenção quente da estação de incorporação de parafina, despeje a cera de parafina para cobrir o fundo do molde.
Usando pinças finas, coloque peças transversais do cérebro, coronal e da medula espinhal na parafina na parte inferior do molde. Transfira o molde para a superfície de resfriamento por vários segundos para fixar o cérebro e as amostras no lugar. Mova o molde de volta para a superfície aquecida e preencha-o até o topo com parafina quente.
Coloque a tampa do rotulada com o ID do espécime no molde. Despeje a parafina por cima da tampa do. Transfira o molde para a estação de resfriamento para permitir que a cera se fixe.
Quando os blocos estiverem completamente frios, prenda o bloco em um micrótomo rotativo. Aparar os blocos e cortar seções de cinco micrômetros de cada bloco de parafina. Mova a fita de parafina para um banho-maria de 42 graus Celsius.
Colete a seção do banho-maria em um escorregador rotulado. Coloque as corrediças em uma cremalheira de plástico e asse as seções durante a noite a 37 graus Celsius em um forno seco. Após a digitalização, abra a imagem J e, em seguida, arraste e solte a imagem tiff da seção para análise.
Observar o corte medular em quatro quadrantes e pontuar a presença de lesões desmielinizantes em cada quadrante. Este corte tem um escore de quatro, pois há lesões nos quatro quadrantes. Este corte pontua um, pois as lesões estão em apenas um quadrante.
A coloração CD45 indica a presença de leucócitos nas lesões. Novas lesões contêm muitas células CD45 em comparação com as mais antigas. Em contraste, novas lesões podem conter menos axônios positivos para SMI-32 em comparação com lesões mais antigas.
Os camundongos do grupo selvagem desenvolveram EAE grave com paralisia completa. Enquanto o grupo OGR1-KO desenvolveu doença leve. Essa diferença no escore clínico correspondeu a variações nas lesões de desmielinização submeníngea, na porcentagem de área de mielina corada na medula espinhal, além disso, a porcentagem de fração de mielina também diferiu significativamente entre camundongos OGR1 e wild e correlacionou-se com o escore cumulativo de EAE.
No EAE, a inflamação no cérebro está localizada principalmente no cerebelo e no tronco encefálico. Áreas adicionais de inflamação podem ser evidentes no cérebro, incluindo nas meninges, perto dos ventrículos, e em outros traços da substância branca, como o nervo óptico e o corpo caloso. A luz sérica de neurofilamentos medida com um ensaio de arranjo de moléculas pequenas detectou níveis mais altos de luz de neurofilamentos séricos em camundongos com EAE em comparação com camundongos saudáveis e esses níveis elevados se correlacionaram com a densidade de SMI-32 positivo na medula espinhal.
