Para começar, pegue um camundongo anestesiado e aplique uma gota de 1% de tropicamida e 2,5% de fenilefrina no olho para dilatar a pupila. Em seguida, aplique um gel oftálmico na córnea para evitar o ressecamento e a catarata induzida pela anestesia. Em seguida, configure um microscópio cirúrgico vertical com um caminho de luz direto em um ambiente estéril para realizar a injeção sub-retiniana.
Para preparar a seringa de vidro de 10 microlitros, retire o cubo da agulha e prenda a agulha romba de calibre 33. Pegue a tampa do cubo de metal e prenda firmemente a agulha na seringa. Lave a agulha com água destilada para testar o vazamento e a permeabilidade da agulha.
Em seguida, esvazie a seringa e reserve-a cuidadosamente. Em seguida, posicione o camundongo anestesiado em uma almofada e oriente o olho de tratamento em direção à objetiva do microscópio. Aplicar cloridrato de proparacaína a 0,5% e aguardar 30 segundos.
Em seguida, aplique 150 microlitros de gel oftálmico no olho e afixe uma tampa redonda. Realizar um exame oftalmológico preliminar observando a córnea, íris, pupila, lente e conjuntiva. Ajuste o plano focal para visualizar o fundo do olho do rato através da pupila.
Em seguida, alinhe a cabeça de modo que a cabeça óptica se alinhe com o centro da pupila. Em seguida, toque na base do tubo contendo progenitores fotorreceptores derivados do HESC para obter uma suspensão celular uniforme. Usando uma seringa de microlitro de vidro de 10 microlitros com uma agulha romba de calibre 33, desenhe dois microlitros de mistura celular.
Use uma agulha descartável de calibre 30 para criar uma ferida de esclerectomia posicionada dois milímetros atrás do limbo. Mantenha o ângulo da agulha em aproximadamente 45 graus para evitar o contato com a lente. Uma vez que a ponta da agulha se torna visível dentro do olho, retraia cuidadosamente a agulha.
Descarte a agulha usada em uma lixeira afiada para evitar ferimentos por picada de agulha. Agora pegue a seringa de vidro e insira a agulha romba na ferida de esclerectomia. Avançar a agulha romba sem tocar no cristalino até atingir a retina oposta da ferida de entrada.
Penetre suavemente na retina até que um ramo de pressão na esclera seja visto. Em seguida, injete dois microlitros da suspensão celular ou do meio PRDM no espaço sub-retiniano, mantendo uma pressão suave sobre a seringa. A formação de uma mancha visível indica injeção bem-sucedida.
Aguarde 10 segundos para permitir que as células se acalmem. Retraia suavemente a agulha do olho. Para visualizar a bolha, mova a cabeça do mouse para posicionar o olho sob o microscópio e segure a posição segurando suavemente a cabeça.
Para OCT intraoperatória, use a função IOCT no microscópio operacional e selecione o cubo na tela da OCT. Posicione a área de digitalização na mancha pressionando os botões de seta. Para ajustar a OCT, a centralização de slides e o foco para obter a melhor qualidade da OCT, pressione a captura ou a digitalização para adquirir a varredura da OCT da área de bleb e revise as imagens para verificar a qualidade das digitalizações.
Por fim, retire a tampa e limpe suavemente o gel do olho com gaze. Administrar pomada antibiótica uma vez após a injeção para prevenir a infecção. O exame de OCT revelou distintas entidades HESC suspensas no olho tratado com células.
Em contraste, o olho tratado com mídia exibia líquido sem turvas, vazio de células dentro do espaço sub-retiniano.
