Para começar, injete o camundongo com vetores associados ao AAV no cérebro do camundongo. Após três a quatro semanas da injeção do vírus, raspe as áreas ventral e posterior do pescoço de um camundongo anestesiado. Limpar as áreas raspadas usando três esfoliantes de iodo em rotação com solução de etanol a 70%.
Faça uma incisão ventral na pele entre as omoplatas. Em seguida, colocar gaze cirúrgica sobre a incisão e posicionar o animal em decúbito dorsal, com a cabeça voltada para o cirurgião. Em seguida, faça uma pequena incisão vertical no lado direito do pescoço, acima da clavícula, para expor a artéria carótida direita e a veia jugular.
Após separar o tecido subcutâneo, expor a veia jugular externa direita e colocar a sutura sob a veia. Amarre a extremidade distal da veia jugular para interromper o fluxo sanguíneo. Usando micro pinças e tesouras, faça uma pequena incisão na veia colapsada.
Agora, insira o cateter venoso com o bisel voltado para baixo e mova-o proximalmente em direção à veia cava superior até atingir o átrio direito. Usando uma sutura de seda 7-0, fixe o cateter ao vaso. Dissecar os tecidos conjuntivos para expor a artéria carótida comum direita.
Proximalmente, pré-colocar duas alças de sutura de seda 7-0 que permanecem despresadas no nível em que as artérias carótidas interna e externa se dividem. Para interromper o fluxo sanguíneo temporariamente, puxe uma alça de sutura pré-colocada. Em seguida, usando uma microtesoura ou uma agulha de calibre 27, crie uma pequena abertura na parede do vaso.
Inserir o cateter arterial proximalmente enquanto libera a alça de sutura e avançar o cateter para alcançar o arco da aorta, sem tocar a valva aórtica. Utilizar as duas suturas pré-colocadas para fixar o cateter ao vaso. Túnel de todos os cateteres por via subcutânea, exteriorizá-los na parte posterior do pescoço através da incisão pré-corte e fechar a incisão ventral.
Junte os cateteres aos orifícios venosos ou arteriais do conector de tubo revestido de silicone feito de tubo de agulha de calibre 25. Após o fechamento da incisão ventral, fixar o conector por via subcutânea quando a pele posterior estiver selada com suturas. Usando fios cirúrgicos de aço inoxidável, preencha os cateteres com soro fisiológico heparinizado e plugue firmemente as extremidades dos cateteres.
Para fixar o animal em um sistema automatizado de coleta de sangue 24 horas após a cirurgia, conecte o gancho de amarração ao anel metálico na parte de trás do pescoço e conecte a linha arterial. Uma vez que o cateter arterial é conectado à linha de injeção, conecte os cateteres venosos às linhas de amostragem. Defina o tempo de injeção e a dose em 0,5 miligramas por quilograma em 500 microlitros por minuto.
Definir o tempo e a frequência de colheita de sangue, incluindo a diluição da amostra com soro fisiológico. O sistema irá repor automaticamente uma quantidade igual de soro fisiológico para substituir o sangue amostrado. Realize a pré-injeção automatizada.
Em seguida, execute uma injeção intravenosa automatizada da droga N-óxido de clozapina a uma taxa de injeção de 500 microlitros por minuto. Em seguida, realize a coleta de sangue pós-injeção. Padrões hormonais luteinizantes em fêmeas adultas de Kiss1-EYFP que receberam uma injeção estereotáxica unilateral de AAV-hM3Dq-mCherry no núcleo arqueado são apresentados.
Os níveis de hormônio luteinizante diestro são geralmente baixos, mas variações são geralmente observadas devido à sua liberação pulsátil. Um aumento acentuado nos níveis de hormônio luteinizante ocorre em resposta à injeção de N-óxido de clozapina. A maioria dos neurônios mCherry co-localizados com Kiss1-EYFP demonstrou que a ativação viral e neuronal é específica para a população-alvo.
Um padrão pulsátil de liberação do hormônio luteinizante em camundongos diestrus do tipo selvagem, seguido pela resposta a uma injeção IP de Kisspeptin-10, é mostrado. Pulsos claros de hormônio luteinizante, típicos de uma fêmea em diestro, foram observados, mostrando baixos níveis basais de hormônio luteinizante. Um aumento imediato e robusto do hormônio luteinizante foi detectado em resposta à administração de Kisspeptina.
