Para começar, adicione 30 gramas de cloreto de sódio em seis litros de água deionizada em um tanque de fluido de bainha e agite o tanque para dissolver o sal. Em seguida, conecte o tanque a um classificador de células. Ligue o classificador de células, inicie o sistema fluídico e aguarde o equilíbrio fluídico.
Configure o atraso de queda. Para preparar a solução estoque de extrato de levedura, ressuspenda uma alíquota de extrato de levedura de carbono 13 em 7,5 mililitros de água ultrapura e 2,5 mililitros de metanol. Em seguida, para preparar o tampão de extração, adicione 10 microlitros de carbono 13 solução estoque de extrato de levedura a 10 mililitros de acetonitrila e misture bem.
Adicione 25 microlitros do tampão de extração a cada poço de uma placa de PCR de 96 poços e cubra os poços com uma tampa. Coloque a placa no classificador de células para coletar as células classificadas. Classifique 5000 eventos cada uma das populações positivas e negativas de Alexa Fluor 647 nos quatro primeiros poços.
Em seguida, classifique 5000 eventos cada uma das populações positivas de PE e 647 negativas de Alexa Fluor nos próximos quatro poços. Em seguida, para células-tronco hematopoéticas, classifique 5000 eventos da população PE-Cy7 baixa, PE positiva, APC-Cy7 positiva, Violeta Brilhante 605 positiva e Violeta Brilhante 421 negativa no primeiro poço, seguida pela classificação de 5000 eventos da população PE-Cy7 baixa, PE positiva, APC-Cy7 positiva, Violeta Brilhante 421 positiva e Violeta Brilhante 605 negativa no poço seguinte. Para amostras de detritos, selecione eventos muito pequenos para representar células intactas com base em sinais de dispersão para frente e para os lados.
Em seguida, ative o instrumento LC-MS. Coloque a placa de amostra no amostrador automático do instrumento. Abra o software compatível com LC-MS e prepare o instrumento para análise.
Execute pelo menos quatro amostras em branco ou de pool de processo para equilibrar a coluna e uma mistura de teste LC para verificar o desempenho cromatográfico. Confirme se a contrapressão inicial e máxima é inferior a 150 e 400 bar, respectivamente. Em seguida, certifique-se de que os tempos de retenção estejam dentro de uma janela de um minuto.
Em seguida, verifique se o vale entre leucina e isoleucina na transição positiva de 132 a 86 é inferior a 20% da altura do pico. Finalmente, certifique-se de que a diferença no tempo de retenção AMP para ADP seja de 1,5 a 1,9 minutos e ADP para ATP seja de 1,1 a 1,5 minutos. Depois de confirmar os parâmetros experimentais, configure uma corrida com uma amostra em branco ou de pool de processo para minimizar a transição da mistura de teste LC, seguida pelas amostras de teste em ordem aleatória.
A classificação FACS permite o isolamento de populações puras de diferentes tipos celulares a partir da mesma suspensão celular. Diferenças metabólicas entre tipos celulares de um mesmo tecido foram preservadas usando o protocolo FACS cell CMS para células-tronco hematopoéticas e células progenitoras multipotentes. Células de seis camundongos foram necessárias para gerar seis amostras, levando a uma maior variabilidade dentro de cada grupo em comparação com as células B e T, que foram separadas do mesmo baço murino.
Amostras de detritos representando amostras de controle em branco do processo foram claramente separadas das amostras contendo extratos celulares. Um mapa de calor mostrando informações sobre os níveis relativos de metabólitos em diferentes tipos de células é mostrado aqui.
