Para começar, encha um copo com dois mililitros de tampão de lise de núcleos gelados contendo 0,01% de digitonina e adicione os pedaços de tecido cerebral de camundongo dissecados nele. Usando um homogeneizador de tecido Dounce de vidro, homogeneizar o tecido 25 vezes cada com pilões A e B, e transferir o homogeneizado resultante para um tubo de 15 mililitros. Adicionar dois mililitros de tampão de lise de núcleos gelados contendo 0,01% de digitonina ao homogeneizado e incubar no gelo por cinco minutos.
Em seguida, centrifugar os núcleos a 500 G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Usando uma micropipeta, remova o sobrenadante e adicione quatro mililitros de tampão de lise de núcleos gelados contendo 0,01% de digitonina. Filtrar a suspensão dos núcleos através de um filtro de células de 40 micrômetros.
Centrifugar os núcleos novamente, remover o sobrenadante e adicionar quatro mililitros de tampão de coloração para lavar os núcleos. Após a filtragem da suspensão através de um filtro celular de 40 micrômetros, peletize os núcleos por centrifugação e ressuspenda os núcleos em um mililitro de PBS contendo 0,04% de BSA e inibidores de RNase. Para contar as células, misture 10 microlitros de azul de tripano a 0,4% com 10 microlitros dos núcleos em um tubo de 0,5 mililitro.
Conte os núcleos usando um contador de células automatizado. Transfira 100 microlitros dos núcleos para um tubo FACS para o controle sem manchas. Adicione 10 microlitros de 7-AAD aos núcleos restantes e incube por cinco minutos a quatro graus Celsius, e prossiga com a triagem dos núcleos usando FACS.
Em seguida, transfira 10 microlitros dos núcleos classificados para um novo tubo FACS contendo 90 microlitros de DPBS com SFB inativada pelo calor a 2%. Após centrifugar os núcleos triados, remova o sobrenadante usando uma micropipeta e ressuspenda os núcleos em 100 microlitros de tampão de núcleos diluídos. Antes da triagem, a amostra contém detritos substanciais com mais de 99% de singlets positivos para coloração nuclear, indicando lise celular eficaz.
Os núcleos cerebrais após a classificação demonstraram um aumento na pureza dos 36% iniciais para quase 100%
