Para começar, enxágue a câmara superior de 24 placas de poço com PBS. Misture as células BEND3 com o meio DMEM usando um misturador de vórtices para fazer uma suspensão. Em seguida, semeie 200 microlitros de suspensão celular BEND3 na membrana PET na câmara superior de uma placa de 24 poços.
Adicione 1.200 microlitros de meio completo à câmara inferior da placa para estabilizar a pressão osmótica das câmaras superior e inferior. Troque o meio removendo lentamente o meio antigo de um lado com uma pipeta de pressão negativa e adicionando um novo meio ao longo da parede durante a troca de fluidos. Antes de medir o TEER, coloque o resistor, solução de hipoclorito de sódio a 5%, etanol a 75% e água bidestilada sobre uma mesa ultralimpa.
Ligue a irradiação UV por 30 minutos para eliminar bactérias residuais e patógenos. Colocar os eléctrodos em solução de hipoclorito de sódio a 5% com agitação lenta durante três a cinco segundos. Em seguida, mergulhe em etanol 75% por 15 minutos.
Por fim, transfira para PBS ou água bidestilada até o uso. Em seguida, ligue o interruptor na parte de trás do medidor de resistor de célula. Clique em Selecionar placa e selecione placa de 24 poços.
De acordo com a operação, selecione a sequência de detecção apropriada. Insira um resistor de quilo ohm no plugue direito para calibrar o instrumento. Se o resultado da calibração for 1000 mais menos 5 ohms, considere o instrumento preciso.
Caso contrário, clique em Unidades de Modo na interface principal para selecionar Ohms e, em seguida, clique em Calibrar. Em seguida, remova o resistor de quilo ohm e substitua-o pelo eletrodo de medição usando um fio de conexão. Coloque o eletrodo verticalmente na placa de 24 poços contendo apenas o meio e clique em Manuseio em branco no instrumento.
O valor de fundo da resistência da placa sem células sentadas deve ser de cerca de 134,4 ohm. Em seguida, insira os dois eletrodos nas câmaras superior e inferior da placa sentada, de modo que a camada celular fique entre eles. Registre o valor da resistência pisando suavemente no pedal.
Certifique-se de que o eletrodo não toque nas células da câmara superior e na parte inferior da câmara inferior. Obter valores TEER multiplicando os valores de resistência elétrica com a área inferior da câmara superior, como mostrado na equação. Desenhe um gráfico de linhas de TEER versus tempo em dias.
Quando o valor da resistência não aumenta com o tempo, as células formam uma barreira. Os valores de resistência plotados versus o tempo para as células BEND3 mostraram que os valores TEER celulares começaram a se estabilizar no quinto dia.
