Para começar, coloque as seções de tecido da mucosa nasal de ratos coradas com hematoxilina e eosina em um palco de microscópio. Ajuste o foco do microscópio até que a imagem fique claramente visível. Capture a imagem do tecido em 40X.
Aqueça o tampão citrato fosfato até ferver. Em seguida, adicione as lâminas ao recipiente depois de removê-lo do fogo. Depois de aquecer por oito minutos até ferver, desligue o fogo por oito minutos e, em seguida, mude para fogo médio baixo por sete minutos.
Depois de deixar o recipiente esfriar naturalmente, transfira as fatias para PBS. Use um agitador descolorante para agitar as fatias por cinco minutos. Em seguida, desenhe um círculo ao redor do tecido seco com uma caneta imunohistoquímica.
Adicionar solução de peróxido de hidrogénio a 3% às fatias antes de incubar. Em seguida, transfira as fatias para PBS para lavagem como antes. Para bloquear, aplique soro de cabra a 5% dentro do círculo marcado.
Após a incubação, remova cuidadosamente a solução de bloqueio e adicione um a dois mililitros de FOXP3 às fatias de tecido. Em seguida, coloque as fatias em uma câmara úmida para incubação durante a noite. Depois de lavar as fatias em PBS, seque suavemente as fatias com papel de filtro.
Em seguida, adicione um a dois mililitros da solução de anticorpos secundários às fatias. Em seguida, incube as fatias em 100 microlitros de solução de trabalho de amplificação de sinal de tiramida por 10 minutos à temperatura ambiente no escuro. Após a incubação, lavar as fatias com PBS três vezes por cinco minutos cada.
Agora aplique de um a dois mililitros de solução corante DAPI nas fatias antes da incubação. Apague a autofluorescência incubando as fatias no quencher por cinco minutos antes de uma lavagem PBS de 10 minutos. Em seguida, selá-los com o quencher antifluorescência.
Capturar as imagens microscópicas dos cortes corados em aumentos de 20X e 40X. As colorações de hematoxilina e eosina dos ratos controle mostraram células epiteliais e cílios bem arranjados. A mucosa do septo nasal estava lesada e descolada no grupo da doença, com infiltração neutrofílica notável.
A coloração por imunofluorescência múltipla revelou que as expressões de ROR Gama T e TCAM1 estavam aumentadas no grupo da doença. No entanto, FOXP3 estava sob expresso.
