Após calibrar os sensores polarográficos de oxigênio, remova as rolhas e abra as câmaras. Lave as rolhas e câmaras com 100% de etanol, 70% de etanol e água destilada. Transfira as moscas para um tubo de microcentrífuga.
Adicione 200 microlitros de tampão MiR05 resfriado no tubo e homogeneize as moscas aplicando uma pressão suave com quatro a seis golpes do pilão. Usando uma micropipeta, transfira a suspensão de mosca homogeneizada para a câmara. Cubra a câmara com uma rolha sem introduzir bolhas de ar.
Em seguida, clique no menu de layout e selecione a Opção 5, Fluxo por Volume Corrigido. Outra nova janela será aberta. Aqui, no espaço, código experimental, nomeie o experimento.
No campo de amostra, nomeie cada amostra em sua respectiva câmara A e B.Em seguida, defina o campo de unidade como Unidade e, no campo de concentração, defina o volume da câmara como um por mililitro. Para iniciar a respirometria de alta resolução, certifique-se de que o sinal de fluxo de oxigênio esteja estável no valor positivo. Adicione digitonina para permeabilizar a membrana mitocondrial.
Em seguida, adicione substratos de piruvato, malato e prolina até que o fluxo de oxigênio aumente e se estabilize. Pressione a tecla F4 no teclado e digite o nome do reagente para marcar o evento. Adicione ADP para acoplar a cadeia respiratória mitocondrial e aguarde o aumento e estabilização do fluxo de oxigênio.
Em seguida, adicione succinato e meça o fluxo de oxigênio. Para inibir a ATP sintase, adicione oligomicina e examine a diminuição do fluxo de oxigênio. Após a estabilização da linha vermelha, desacople a transferência de elétrons mitocondrial usando FCCP 0,25-micromolar até atingir o consumo máximo de oxigênio, demonstrado pelo aumento da linha vermelha.
Em seguida, adicionar inibidor do complexo I de rotenona e aguardar a diminuição e estabilização do fluxo de oxigênio. Em seguida, adicione o inibidor do complexo II do malonato e meça o fluxo de oxigênio. Finalmente, adicionar inibidor do complexo III antimicina e aguardar a diminuição, seguida do aumento e estabilização do fluxo de oxigênio.
Clique no software GraphPad Prism para extrair os valores de fluxo de oxigênio dos gráficos. OXPHOS CI refere-se ao valor do fluxo de oxigênio após a adição de ADP. Em seguida, use a fórmula fornecida para calcular OXHPOS CII.
Usando a seguinte equação, calcule os valores de oxigênio CI e CII da ETS para os desacopladores e inibidores. Em seguida, calcule a síntese de ATP como a diferença entre o OXPHOS e o LEAK. Finalmente, calcule a razão OXPHOS por LEAK para determinar a razão de controle respiratório.
O fluxo de oxigênio nos estados OXHPOS CI e OXPHOS CI e CII foi significativamente reduzido em moscas nulas PINK1 B9. em comparação com moscas controle. Além disso, o fluxo de oxigênio no estado ETS CI, ETS CII e ETS CI e CII foi menor nas moscas nulas PINK1 B9, indicando um sistema de transferência de elétrons prejudicado em comparação com as moscas controle.
A interrupção no fluxo de elétrons afeta o processo OXFOS, levando à redução da síntese de ATP nas moscas nulas PINK1 B9. A redução na razão de controle respiratório de moscas nulas sugere desacoplamento mitocondrial, indicando que as mitocôndrias foram menos eficientes na utilização de oxigênio e produção de ATP.
