Preparation of FFPE DNA and RNA Samples for Sequencing Using an Automated Purification Instrument (API)

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02:34 min

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September 8th, 2023

DOI :

10.3791/200724-v

September 8th, 2023

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Christophe Bontoux¹^,²^,³^,⁴^,⁵, Virginie Lespinet-Fabre¹^,²^,³^,⁴, Olivier Bordone¹^,²^,³^,⁴, Virginie Tanga¹^,²^,³^,⁴, Maryline Allegra¹^,²^,³^,⁴, Myriam Salah¹^,²^,³^,⁴, Salomé Lalvée¹^,²^,³^,⁴, Samantha Goffinet¹^,²^,³^,⁴, Jonathan Benzaquen³^,⁴^,⁵^,⁶, Charles-Hugo Marquette³^,⁴^,⁵^,⁶, Marius Ilié¹^,²^,³^,⁴^,⁵, Véronique Hofman¹^,²^,³^,⁴^,⁵, Paul Hofman¹^,²^,³^,⁴^,⁵

¹Laboratory of Clinical and Experimental Pathology, Centre Hospitalier Universitaire de Nice, Université Côte d’Azur, CHU de Nice, ²Hospital-Integrated Biobank (BB-0033-00025), Université Côte d'Azur, Hôpital Pasteur, CHU de Nice, ³Institut Hospitalo-Universitaire (IHU), RespirERA, Université Côte d'Azur, Hôpital Pasteur, CHU de Nice, ⁴FHU OncoAge, Université Côte d'Azur, ⁵Team 4, Institute of Research on Cancer and Aging (IRCAN), CNRS INSERM, Centre Antoine-Lacassagne, Université Côte d'Azur, ⁶Department of Pulmonary Medicine and Thoracic Oncology, Centre Hospitalier Universitaire de Nice, Université Côte d'Azur

Transcrição

Para começar, corte as amostras de DNA e RNA fixadas em formalina ou fixadas em parafina ou FFPE. Ative o instrumento de purificação automatizada ou API e faça login com o nome de usuário e senha. Em seguida, no software Integrated Genomic Viewer, em amostras, clique em Criar amostras", insira o nome da amostra e selecione a categoria do aplicativo.

Depois de inserir os detalhes da amostra, clique em Salvar"Em seguida, selecione Execuções"clique em Amostra para Resultado"e digite o nome da execução antes de clicar em Avançar"Selecione o ensaio seguido por uma amostra de interesse e clique em Avançar"Depois de selecionar cada amostra, clique em Atribuir"Em seguida, verifique os parâmetros de eluição e salve a execução. Coloque amostras de tecido FFPE e tubos de processamento de amostras. Centrifugar o tubo a 2.000 G durante um minuto.

Adicione a mistura mestra Protease Digest preparada a partir de um kit de purificação de ácido nucleico no tubo. Incubar a amostra a 60 graus Celsius durante uma hora, seguida de incubá-la a 90 graus Celsius durante uma hora. Depois de resfriar as amostras, levante o tubo interno do tubo de processamento de amostras e trave-o virando à esquerda.

Centrifugar o tubo interno a 2.000 G por 10 minutos. Em seguida, destrave o tubo virando à direita e separando-o do outro tubo. Descarte o tubo interno e coloque o tubo externo no gelo até carregar no API.

Prepare uma mistura mestre de digestão de DNA e carregue na placa dois pré-preenchida de DNA FFPE e Purificação de RNA. Carregue as amostras preparadas em FFPE DNA e placa de purificação de RNA um. Na tela da API, clique em Executar", selecione o plano de execução e clique em Avançar"Siga as instruções na tela para carregar os consumíveis e reagentes necessários para a execução de purificação.

Depois que todos os reagentes forem carregados, clique em Avançar"feche a porta da API e clique em Iniciar"T no final da execução, clique em Descarregar" e remova imediatamente a placa de arquivo de ácido nucleico de 48 poços contendo o DNA e o RNA purificados. Após o término da purificação da amostra, sele a placa e armazene-a a 80 graus Celsius negativos.

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