Para identificar as células de nicho limbal ou LNCs pela coloração de imunofluorescência, adicionar 1 mililitro de EDTA de tripsina a 0,25% por poço aos LNCs cultivados em uma placa de 6 poços revestida com matrigel a 5%. Digerir as células incubando a placa por cinco minutos a 37 graus Celsius. Atenuar a digestão adicionando 1 mililitro de soro nocaute contendo MESCM à suspensão celular.
Transfira a suspensão celular para um tubo centrífugo e centrifuga-a 200G por cinco minutos antes de aspirar cuidadosamente o sobrenadante. Ressuspenda o pellet em um mililitro de MESCM. Em seguida, usando um citófugo, deposite 80 microlitros da suspensão celular igualmente em quatro lâminas de microscópio de acordo com as instruções do fabricante.
Fixar as células com paraformaldeído a 4% durante aproximadamente 10 minutos. Em seguida, permeabilizar as células nas lâminas usando 0,2% Triton X-100 em PBS por 15 minutos. Bloquear as células com albumina de soro bovino a 2% durante uma hora antes de incubá-las com anticorpos primários num agitador durante a noite a 4 graus Celsius.
Após a incubação, remova os anticorpos não ligados lavando as lâminas com PBST três vezes por cinco minutos cada. Em seguida, incube a amostra com anticorpos secundários adequados a 37 graus Celsius por uma hora antes de lavar quaisquer anticorpos não ligados, como demonstrado anteriormente. Contramanchar os núcleos com DAPI tendo uma concentração de 5 microgramas por mililitro.
Após selar as lâminas, realizar a obtenção de imagens usando um microscópio de fluorescência. Usando um kit de isolamento de RNA, extraia o RNA total dos LNCs de acordo com as instruções do fabricante. Em seguida, usando um kit de transcrição de DNA complementar ou CDNA de alta capacidade, transcreva reversamente 1 a 2 microgramas do RNA.
Preparar uma solução de 20 microlitros contendo 2,5 microlitros de CDNA, 0,8 microlitros de primer genético correspondente, 10 microlitros de uma mistura mestre universal de PCR e 6,7 microlitros de água bidestilada. Em seguida, realizar uma reação quantitativa em cadeia da polimerase usando as condições apropriadas. Finalmente, empregar a técnica de TC comparativa para examinar a expressão gênica relativa.
A dupla imunomarcação dos LNCs de quarta passagem revelou claramente que essas células eram consistentemente panCK negativas, VIM positivas, CD90 positivas, CD105 positivas, SCF positivas e PDGFR positivas.
