Para começar, as hiPSCs de cultura em meio de manutenção IPSC em uma placa de cultura de tecido de seis poços revestida com gel de matriz extracelular reduzido com fator de crescimento. Quando as células atingirem 80 a 90%v, retire o meio da placa e lave as células uma vez com DPBS. Em seguida, adicione 700 a 800 microlitros de EDTA 0,48 milimolar e incube por um minuto à temperatura ambiente.
Retire a solução de digestão e incube a placa a 37 graus Celsius por três a cinco minutos. Quando as células forem digeridas em folhas, adicione dois mililitros de meio de manutenção IPSCs para encerrar a digestão. Transfira a suspensão da célula para uma placa de fixação baixa de seis poços.
Incubar as células a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono e 60 RPM para formar corpos embrionários esféricos ou EBs. Após 24 horas, usando uma pipeta passada, transferir os EBs para o tubo centrífugo e deixá-lo sedimentar por cinco a 10 minutos antes de remover o sobrenadante. Adicione o meio de diferenciação MSC ao tubo e transfira os EBs para uma lâmina de fixação baixa de seis poços com dois mililitros de meio de diferenciação MSCs.
Cultivar os EBs no agitador a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por sete dias. No oitavo dia, transferir os EBs para o tubo centrífugo, conforme demonstrado anteriormente. Uma vez sedimentados os EBs, remova o sobrenadante do tubo.
Adicionar meio de manutenção de CTM no tubo e transferir as EBs para uma placa de seis poços revestida com gel de matriz extracelular reduzida com fator de crescimento com dois mililitros de meio de manutenção de CTM. Após a adesão celular, trocar o meio até que a cultura atinja 90% de confluência. Em seguida, tratar a cultura derivada da EB com uma solução de dissociação a 37 graus Celsius.
Quando parte das células for digerida em células únicas, adicione dois mililitros do meio de manutenção MSC para encerrar a digestão e transferir a suspensão celular para um tubo de centrífuga. Lave as células restantes não digeridas dos poços uma vez com DPBS. E digerir novamente como demonstrado anteriormente.
Em seguida, centrifugar a suspensão celular a 250g por cinco minutos. Retire o sobrenadante e semeie as células em uma placa de cultura revestida com gelatina. Cultivar as células em meio de manutenção de CTM a 90% de confluência com troca regular do meio.
Linhas hiIPCs de cultura como demonstrado anteriormente. Quando as células atingirem 50 a 60% de confluência, remova o meio de manutenção IPSC da placa. Adicione dois mililitros de meio de manutenção MSC.
E cultura por 14 dias a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono com mudança diária de meio. Para a maturação das CTMs, tratar a cultura de monocamada com uma solução de dissociação a 37 graus Celsius. Quando parte das células for digerida em células únicas, adicione dois mililitros do meio de manutenção MSC nos poços para encerrar a digestão e transferir a suspensão celular para um tubo de centrífuga.
Lave as células restantes não digeridas uma vez com DPBS e digere-as como demonstrado anteriormente. Em seguida, centrifugar a suspensão celular como demonstrado anteriormente e semear as células em uma placa de cultura revestida com gelatina. Cultivar as células em meio de manutenção de CTM a 90% de confluência com troca regular do meio.
No método de formação de EB, colônias de hiIPCs exibiram uma morfologia compacta antes da diferenciação. Após a dissociação, formaram-se EBs esféricas uniformes, que foram ganhando volume ao longo do tempo. Posteriormente, as EBs transformaram-se em células aderentes da monocamada atingindo 90% de confluência até o 18º dia e adquirindo uma morfologia fusiforme após duas passagens.
Da mesma forma, no método da monocamada, as células proliferaram formando células aderentes multicamadas. Depois de empacotadas várias vezes, as células amadureceram em CTM com uma forma típica de fuso e colônia giratória. A análise por citometria de fluxo revelou que os hiIPCs foram positivos para CD90 e negativos para CD34, CD45, CD105 e CD73.
Após a diferenciação, os hiIPCs que conduzem as CTMs expressaram CD90, CD73 e CD105, permanecendo negativos para CD34 e CD45. As CTMs derivadas da monocamada apresentaram maior concentração de depósito de cálcio do que o método EB. Entretanto, não foram observadas diferenças significativas nas habilidades de diferenciação adipogênica e condrogênica.
As habilidades de proliferação de ambos os métodos foram mantidas por até 20 passagens.
