Para começar, colete as amostras de urina de indivíduos saudáveis. Centrifugar 12 mililitros de amostra em um tubo cônico de 15 mililitros para eliminar restos celulares em grandes corpos apoptóticos. Em seguida, transfira 10 mililitros do sobrenadante para um tubo fresco de 15 mililitros.
Adicione um mililitro de tampão de carga e 200 microlitros de polpa de grânulos de armadilha EV à amostra. Incubar a amostra à temperatura ambiente durante 30 minutos com rotação final sobre extremidade. Para pellet a amostra, coloque o tubo cônico de 15 mililitros em um rack separador magnético.
Retire cuidadosamente o sobrenadante e ressuspenda as contas em um mililitro de tampão de lavagem. Em seguida, transfira a suspensão para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro e pipete suavemente para ressuspender a vesícula extracelular ou as esferas ligadas ao EV. Coloque o tubo da microcentrífuga em um rack separador magnético para tubos de 1,5 mililitros.
Usando uma pipeta P200, aspirar cuidadosamente o sobrenadante. Agora, lave as contas com um mililitro de tampão de lavagem, seguido de duas lavagens com um mililitro de PBS à temperatura ambiente. Incubar as contas com 100 microlitros de Trietanolamina 100 milimolar recém-preparada por cinco minutos.
Usando o rack separador magnético de tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro, colete a solução iludida contendo EVs. Depois de combinar as soluções escapadas, seque o eluíte, usando um concentrador centrífugo a vácuo a quatro graus Celsius.
