Para começar, pegue a amostra de vesícula extracelular seca obtida da urina humana usando a abordagem EV trap. Prepare um novo tampão de lise com os componentes mostrados. Em seguida, adicione 100 microlitros de tampão de lise para solubilizar a amostra de EV seca.
Aqueça a amostra a 95 graus Celsius durante 10 minutos enquanto agita a 1.100 RPM. Depois de arrefecer a amostra à temperatura ambiente, dilua-a cinco vezes adicionando 400 microlitros de TEAB 50 milimolares. Meça a concentração de proteína usando um kit de ensaio BCA de acordo com as instruções do fabricante.
Adicione a mistura de tripsina e lisina C à amostra e incube a 37 graus Celsius durante a noite com agitação a 1, 100 RPM. Em seguida, adicione 50 microlitros de ácido trifluoroacético a 10% ou TFA para acidificar a amostra. Além disso, adicione 600 microlitros de acetato de etila às amostras e agite a mistura por dois minutos.
Centrifugar a amostra durante três minutos a 20.000 G e remover cuidadosamente a camada superior sem perturbar a interface. Secar a fase aquosa usando um concentrador centrífugo a vácuo. Agora ressuspenda a amostra seca em 200 microlitros de TFA 0,1% para acidificar peptídeos.
Para dessalgar a amostra, utilizar uma ponta dessalinizadora CA18 e condicioná-la com 200 microlitros de TFA 0,1% e acetonitrila 80%, seguida de duas lavagens com 200 microlitros de TFA 0,1%. Coloque a amostra de peptídeo acidificado na ponta e lave-a três vezes com 200 microlitros de TFA 0,1%. Eluir os peptídeos com 200 microlitros de TFA 0,1% e acetonitrila 80%.
Após o desenho do eluente como demonstrado, ressuspenda a amostra seca para fosfoproteômica em 200 microlitros de tampão de carregamento para enriquecimento de fosfopeptídeos. Adicione 50 microlitros das contas à amostra e agite vigorosamente durante 20 minutos à temperatura ambiente. Coloque a amostra com as contas na ponta frita e centrifuja por um minuto a 100 G.Lave a ponta sucessivamente com 200 microlitros de tampão de carga, lavando os tampões um e dois.
Coloque a ponta com contas em um novo tubo para coletar os fosfopeptídeos escapados. Adicione 50 microlitros de tampão de eluição à ponta e centrifuja por dois minutos a 20 G. Em seguida, seque os fosfopeptídeos escapados usando um concentrador de centrífuga a vácuo.
