Para começar, prepare amostras de proteoma e fosfoproteoma das vesículas extracelulares isoladas das amostras de urina usando a abordagem EVtrap. Injetar as amostras no espectrômetro de massa de tempo de voo de mobilidade iônica aprisionado através do sistema de cromatografia líquida. Separe os peptídeos em uma coluna C18 de 15 centímetros.
Para análise proteômica, adquirir dados usando o método dia-PASEF com uma faixa de massa por rampa para abranger de 300 a 1200 relação massa-carga e constante de mobilidade iônica de 0,6 a 1,50 1/Knot. Para a análise fosfoproteômica, adquirir dados usando um método de aquisição dia-PASEF. Defina a faixa de massa por rampa para abranger de 400 a 1550 relação massa/carga na constante de mobilidade iônica de 0,6 a 1,50 1/Knot.
Carregue os arquivos brutos no software proteômico. Configure os parâmetros de pesquisa no banco de dados do homo sapiens. Para Tipo de Resumo, selecione Específico e, em Enzimas, selecione Tripsina.
Defina o comprimento do peptídeo para um mínimo de 7 e um máximo de 52 e permitir duas clivagens perdidas. Em seguida, defina o Máximo de Modificações Variáveis como 5. A Modificação Fixa deve ser Carbamidometil na Cistina, enquanto as Modificações Variáveis devem incluir Proteína Acetil N-Terminal, Oxidação na Metionina, e Fosforilação em Serina, Treonina e Tirosina.
Finalmente, defina a taxa de descoberta falsa para correspondência de espectro de peptídeo, peptídeo e grupo de proteínas como 0,01. No perfil proteômico LCMS e MS, 2% de cada amostra revelou mais de 11.000 peptídeos únicos de aproximadamente 2.200 proteínas. Notavelmente, 72% das proteínas únicas foram consistentemente encontradas em todas as três réplicas e 90 marcadores EV e proteínas superiores foram identificados em comparação com o banco de dados ExoCarta.
A precisão quantitativa foi confirmada com um baixo-médio coeficiente de variação de 5,7%, significando alta reprodutibilidade e confiabilidade. Para a fosfoproteômica, 98% de cada amostra de peptídeo produziu 800 fosfopeptídeos únicos e 350 fosfoproteínas. O enriquecimento resultou em 72% de fosfoserina, 22% de fosfotreonina e 6% de peptídeos de fosfotirosina.
42% dos fosfopeptídeos foram identificados em todas as réplicas em um coeficiente de variação médio de 21,8%, indicando reprodutibilidade quantitativa aceitável.
