Para começar, incube os embriões de peixe-zebra injetados a 28 graus Celsius. Cerca de 1,5 HPF no estágio de quatro a 16 células, remover embriões não fertilizados e insalubres. Para o ensaio de fenotipagem, envolver a placa controle não exposta com embriões não injetados e injetados em papel alumínio.
Posicione a placa coberta com papel alumínio na prateleira inferior e a placa exposta na prateleira superior da caixa de luz de 28 graus Celsius. Depois de confirmar que a tampa do prato está no lugar, ative a luz azul e feche a porta da caixa de luz para evitar a exposição involuntária à luz ambiente. Para o ensaio de imunofluorescência em torno de 1,5 HPF, envolva individualmente as placas expostas e não expostas em papel alumínio, mantendo a placa de substituição desembrulhada.
Coloque todos os pratos na caixa de luz de 28 graus Celsius sem ativar o LED. Feche a porta da caixa de luz para evitar a exposição inadvertida à luz ambiente. Em aproximadamente cinco HPF, use um escopo dissecante para avaliar o estágio de desenvolvimento dos embriões substitutos.
Remova também os pratos embrulhados para garantir uma exposição uniforme à temperatura em todos os pratos. Quando os embriões proxy atingirem 40% de epibolia, descubra o prato exposto e coloque-o na prateleira superior da caixa de luz. Mantenha o prato não exposto coberto na prateleira inferior.
Ative imediatamente a luz azul, feche a porta e defina um temporizador para 20 minutos. Para se preparar para a fixação, elimine o máximo de luz ambiente possível. Pouco antes da fixação, pegue tubos contendo formol a 4% de quatro graus Celsius e posicione-os ao lado da caixa de luz.
Após 20 minutos, abra a porta da caixa de luz e retire o prato que não foi exposto à luz. Use uma ponta de pipeta de vidro flamejada para remover os embriões sensíveis à luz do prato. Em seguida, para imergir os embriões em formol a 4%, submergir a ponta da pipeta de vidro flamejado no formaldeído e deixar que os embriões afundem no líquido.
Armazene embriões fixos a quatro graus Celsius durante a noite.
