Para começar, coloque o reagente de dissociação celular HBSS EGM-2 e DMEM em banho-maria de 37 graus Celsius por 10 a 15 minutos. Descongelar a trombina e a laminina durante a noite a 4 graus Celsius e fibrinogênio à temperatura ambiente. Adicione 1,5 microlitros de trombina em um tubo de microcentrífuga de 500 microlitros.
Coloque uma placa de alto rendimento esterilizada por UV em um exsicador por 30 minutos para remover o ar preso na microfluídica. Colocar o frasco T75 ao microscópio em aumento de 4x para confirmar a confluência celular e a eficiência da transdução. Lave as células duas vezes com cinco mililitros de HBSS.
Em seguida, adicionar um mililitro de reagente de dissociação ao balão e incubar a 37 graus Celsius com dióxido de carbono a 5% durante um a dois minutos. Bata suavemente o balão com a palma da mão e observe ao microscópio que todas as células foram levantadas. Lave as células com nove mililitros de meio apropriado e colete a suspensão para um tubo cônico de 15 mililitros.
Remova imediatamente uma pequena alíquota e conte as células. Centrifugar a suspensão da célula a 300G e quatro graus Celsius por três a cinco minutos. Em seguida, retire o sobrenadante e ressuspenda o pellet em meio apropriado sobre gelo.
Usando a equação dada, calcule o número de células necessárias. Ressuspenda as células em uma concentração de 1 vezes 10 a 6 células por mililitro e calcule o volume de células necessário usando a seguinte equação. Centrifugar o volume necessário de suspensão celular conforme demonstrado.
Em seguida, em um volume calculado de fibrinogênio, ressuspenda o pellet sobre gelo.
