Para começar, coloque as placas de alto rendimento esterilizadas por UV e as alíquotas de trombina na capa de cultura de tecidos. Coloque a mistura de fibrina celular preparada no gelo para retardar a coagulação. Usando uma pipeta P20, desenhe seis microlitros da mistura de fibrina celular.
Em seguida, coloque suavemente a ponta da pipeta na alíquota de trombina e misture duas vezes sem introduzir bolhas de ar. Levante a placa de alto rendimento em um ângulo e insira rapidamente a ponta da pipeta em uma das portas de carregamento. Empurre o êmbolo da pipeta para a primeira parada em um movimento suave e fluido e injete a mistura de fibrina celular na câmara de tecido.
Certifique-se de que o gel atravessa totalmente a câmara. Coloque suavemente a placa plana sem remover a ponta da pipeta ou deslocar a pipeta. Retire a ponta da pipeta com uma mão do P20 e deixe-a no orifício da porta de carga.
Após dois minutos, remova as pontas da pipeta com movimentos suaves de torção das portas de carga e coloque a tampa sobre a placa. Incubar a placa por 15 a 20 minutos a 37 graus Celsius para polimerização em gel. Coloque o dispositivo microfluídico no palco do microscópio para observar a distribuição uniforme das células por toda a câmara sem bolhas de ar.
Insira a ponta da pipeta P20 em M1 ou M3 e expulse quatro microlitros de laminina lentamente para revestir todo o painel superior. Retire a ponta da pipeta como demonstrado anteriormente e incube a placa a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono por 10 minutos. Adicione 275 microlitros de meio completo EGM-2 aos reservatórios desacoplados dos poços localizados nas fileiras A e B.Insira a ponta da pipeta P200 no orifício de entrada do meio dos poços contendo 275 microlitros de EGM-2 e expulse lentamente 75 microlitros de meio, observando a mídia viajar pelo canal e borbulhar do outro lado.
Depois de remover a ponta da pipeta, empurre o meio restante da ponta para o reservatório do meio. Adicione 50 microlitros de meio para cobrir totalmente os poços laterais baixos nas fileiras G e H.Incube as placas por uma a duas horas, conforme demonstrado. Sob um microscópio, identifique quaisquer bolhas nos canais de mídia e remova-as reintroduzindo 75 microlitros de mídia nos canais.
Verifique as entradas ou saídas médias em busca de bolhas de ar a olho nu. Em seguida, insira a ponta da pipeta P200 no orifício e puxe a bolha para fora levantando o êmbolo. Em micro-órgãos vascularizados ou VMOs, as células endoteliais inicialmente se distribuíram uniformemente dentro da câmara tecidual, mas no segundo dia, começaram a se esticar e luminizar.
No quarto dia, as células endoteliais anastomosaram-se com os canais microfluídicos externos, formando uma rede vascular contínua. A função de barreira vascular apertada foi confirmada pela perfusão de FITC-dextran através da rede microvascular com vazamento mínimo. A perfusão de células cancerosas MDA-MB-231 nos VMOs resultou em sua aderência ao revestimento endotelial e subsequente extravasamento para o espaço extracelular, formando múltiplas micrometástases dentro de 24 horas pós-perfusão.
Através de imagens microscópicas de lapso de tempo, o extravasamento de células T para o espaço extracelular dos VMOs foi observado ao longo de 45 minutos. Em microtumores vascularizados com vasos totalmente formados, as células T aderiram rapidamente à parede vascular após a perfusão.
