Para iniciar o uso de pipeta sorológica, retirar o meio de crescimento do frasco T75 contendo cultura MDA-MB-231 70% confluente. Adicionar três mililitros de tripsina ao balão e incubar a 37 graus com 5% de dióxido de carbono durante três a cinco minutos para separar as células do frasco. Em seguida, para neutralizar a tripsina, adicione três mililitros de DMEM no frasco.
Recolher a suspensão celular num tubo de centrifugação e girar a 400 G durante quatro minutos. Descarte o sobrenadante usando uma pipeta e ressuspenda o pellet em dois mililitros de PBS. Usando um contador de células, determine a concentração celular.
Transfira oito vezes 10 para a quinta célula em um tubo de 15 mililitros e adicione PBS para fazer o volume para um mililitro. Em seguida, adicione dois microlitros de CFSE no tubo e misture bem a suspensão celular usando uma pipeta de um mililitro. Coloque o tubo a 37 graus Celsius e incubadora de dióxido de carbono a 5% durante 20 minutos.
Em seguida, adicione cinco mililitros de DMEM ao tubo e centrífuga para pellets para baixo das células marcadas com CFSE. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em um mililitro de DMEM. Após reavaliar a concentração celular, transferir quatro vezes 10 para a quinta célula para um reservatório de reagente de 25 mililitros.
Adicione DMEM para fazer o volume de oito mililitros e misture a suspensão celular com uma pipeta sorológica de cinco mililitros. Usando uma pipeta multicanal, transfira 100 microlitros de suspensão celular para cada fileira na metade esquerda de uma placa preta de 96 poços. Da mesma forma, adicione a suspensão de célula de nocaute EGFR na metade direita da placa.
Para garantir uma distribuição uniforme das células, mova a placa para frente e para trás e de um lado para o outro na plataforma. Incubar a placa por quatro horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono para que as células tumorais se fixem. Com base na contagem de células Jurkat não transduzidas e expressas por CAR, transfira quatro vezes 10 para a quinta célula CAR-J em um reservatório de 25 mililitros.
Adicione DMEM ao reservatório para um volume final de dois mililitros. Para uma relação efetor para tumor de 4:1, adicione duas vezes 10 à quarta célula CAR-J por poço em 100 microlitros de meio ao longo do lado do poço sem perturbar as células tumorais anexadas. Em seguida, adicione 100 microlitros de DMEM ao lado dos poços contendo células tumorais e Jurkat para obter 300 microlitros de volume por poço.
Mova a placa conforme demonstrado para garantir uma distribuição uniforme das células Jurkat nas células tumorais. Permitir que a co-cultura se estabeleça a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono durante 48 horas.
