Depois de co-cultivar CAR expressando jurkats com células tumorais marcadas com CFSE, inverta suavemente a placa em um papel toalha e toque para descartar os sobrenadantes contendo CAR-J. Usando uma pipeta multicanal, adicione 100 microlitros de meio FluoroBrite DMEM contendo iodo propídio, ou PI, nos poços sem perturbar as células tumorais aderidas. Em seguida, adicione 20 microlitros de 20% Triton X ao primeiro poço de cada tipo de tumor, servindo como um controle morto total.
Incubar a placa a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 20 minutos antes da aquisição de imagens. Após a imagem fluorescente, use um dos poços de células somente para tumores para calibrar o canal fluorescente verde. Para excluir células na borda dos poços, diminua a máscara do poço para 98%Identifique as células tumorais marcadas com CFSE no canal fluorescente verde e ajuste o valor do limiar de intensidade de fluorescência para capturar todas as células no poço.
Defina o diâmetro mínimo da célula para 25 micrômetros para excluir detritos detectados no canal CFSE. Em seguida, habilite objetos de toque separados para identificar células individuais. Em seguida, defina portas para definir populações de células vivas versus mortas.
Selecione as células marcadas com CFSE e gere um histograma de contagens no eixo y versus intensidade média do IP no eixo x. Ajuste o valor do eixo x para visualizar melhor as células e desenhe um divisor para diferenciar entre células coradas com baixo IP e células coradas com alto PI. Rotular as células coradas com baixo IP como células vivas.
Em seguida, defina outro histograma em células vivas com área no eixo x e conte no eixo y. Rotular as células não-detritos como grandes células vivas. Em seguida, desenhe outro divisor usando o tumor apenas bem para capturar células e filtrar detritos.
Após executar a análise em toda a chapa, exporte a planilha contendo os números. Plotar as contagens de grandes células para determinar o número de células tumorais vivas marcadas com CFSE remanescentes no poço após a exposição ao CAR-J. Finalmente, realizar análise estatística usando ANOVA one-way.
A citotoxicidade do CAR-J1 aumentou com uma relação efetor para tumor mais alta e mais de 50% foi observada em uma relação efetor/tumor de quatro para um. Construções CAR direcionadas ao EGFR com domínios de dobradiça modificados mostraram morte antígeno-específica contra células EGFR expressando MDA-MB-231, e nenhuma morte significativa foi observada contra células knockout de EGFR. As construções CAR também foram expressas em células T CD3 derivadas do PBMC.
Entretanto, não houve expressão de EGFR-CAR contendo dobradiças CD8. O IgG curto apresentou a menor potência citotóxica contra células MDA-MB-231 em comparação com o meio IgG longo e IgG.
