Para começar, remova a medula espinhal de um rato decapitado que tenha sido perfundido com PBS. Submergir a medula espinhal em DPBS fria em uma placa de Petri sobre gelo. Com uma agulha de calibre 18 e uma seringa de 10 mililitros preenchida com DPBS frio, use extrusão hidráulica para isolar toda a medula espinhal em uma capela de fluxo laminar.
Transfira a medula espinhal para a placa de Petri com DPBS fria colocada em bolsas de gelo. Usando um microscópio dentro da capela de fluxo laminar, remova cuidadosamente quaisquer meninges visíveis com pinças afiadas. Em seguida, transfira a medula espinhal para uma placa de Petri vazia e use uma lâmina de bisturi cirúrgica No.10 para cortá-la em seções de dois a três milímetros de comprimento.
Para dissociação enzimática das células espinhais, adicione as misturas enzimáticas 1 e 2 aos pedaços da medula espinhal. Gire as enzimas no prato várias vezes para garantir um revestimento uniforme da medula espinhal. Incube o prato a 37 graus Celsius por 30 minutos, girando manualmente o prato a cada 10 minutos.
Após a incubação, adicione 350 microlitros de DNAse I.Agite o prato suavemente para misturar. Em seguida, adicione um mililitro de DMEM frio suplementado com 0,5% FBS antes de misturar suavemente. Transfira imediatamente todo o conteúdo para um tubo de cinco mililitros.
Com uma pipeta P1000, triture suavemente o tecido três vezes. Em seguida, use uma pipeta de vidro Pasteur de nove polegadas plugada para triturar suavemente o tecido mais cinco vezes. Coloque o tubo na posição vertical por 30 segundos para permitir que o tecido se assente.
Com uma pipeta P1000, aspirar o sobrenadante e transferi-lo através de um filtro de 30 micrômetros para um tubo cônico de 15 mililitros. Ao tubo com os tecidos restantes, adicione um mililitro de DMEM suplementado com FBS. Em seguida, triture suavemente três vezes com uma pipeta Pasteur.
Depois de deixar o tecido assentar no fundo, passe o sobrenadante através de um filtro de 30 micrômetros e colete-o no mesmo tubo de 15 mililitros usado anteriormente. Centrifugar a suspensão da célula filtrada a 300 g durante 10 minutos à temperatura ambiente. Use um aspirador a vácuo para descartar cuidadosamente o sobrenadante.
Use a solução de remoção de detritos fornecida no kit de dissociação do cérebro adulto para remover a mielina da pelota celular. Em seguida, adicione cinco mililitros de DMEM suplementado com FBS ao pellet e inverta suavemente o tubo três vezes para misturar. Após a centrifugação, descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet de células em um mililitro de DPBS suplementado com FBS.
Centrifugar novamente antes de descartar o sobrenadante. Marcadas as células com Microesferas Anti-ACSA-2 seguindo o protocolo do fabricante. Use as colunas de separação magnética para separar as células por seleção positiva.
Em seguida, centrifugar as células a 300 g por 10 minutos antes de descartar o sobrenadante. Em seguida, ressuspenda o pellet de célula em um mililitro de DMEM aquecido suplementado com FBS. Transfira a suspensão celular para um hemocitômetro para contagem das células e avaliação de sua viabilidade.
Ajuste a concentração celular para 75.000 células por 50 microlitros com FBS DMEM. Em seguida, transfira 50 microlitros da suspensão celular para uma lamínula revestida de poli-l-lisina em uma placa de 24 poços. Incubar a placa a 37 graus Celsius por duas horas para permitir que as células adiram à lamínula.
Em seguida, adicione cuidadosamente 450 microlitros de DMEM FBS quente e suplementado com antibiótico a cada poço. Isolamento e proliferação bem sucedidos de micróglia e astrócitos foram observados. No quarto dia, observou-se que os astrócitos formavam processos mais longos, enquanto células microgliais ovais com fusos mais curtos foram vistas.
Os astrócitos formaram uma camada confluente conectada no sétimo dia, com a micróglia exibindo processos cada vez mais curtos. A triagem celular confirmou a viabilidade celular de 92 a 93% da cultura celular isolada.
