Para começar, coloque as inserções de cultura de células em uma placa adaptadora de cultura de tecido de 24 poços. Pré-revestir a face apical das pastilhas com 100 microlitros de matriz extracelular da membrana basal ou EMB em meio de crescimento enteróide. Revestir uma pastilha extra para uso como controle durante medições de integridade de barreira.
Em seguida, incube a pastilha revestida a 37 graus Celsius sob 5% de dióxido de carbono por uma hora. Uma vez concluída a incubação, aspirar o meio de cultura enteróide 3D. Colher os enteróides ileais bovinos em 1 mililitro de lava gelada.
Use um raspador de células para separar as cúpulas e coletá-las em um tubo cônico de 15 mililitros. Com uma ponta de pipeta de 1 mililitro, triture 30 vezes para gerar fragmentos enteróides. Em seguida, use uma ponta de pipeta de 200 microlitros para triturar ainda mais cerca de 40 vezes para quebrar os fragmentos enteróides.
Completar o volume do tubo para 10 mililitros com meio de lavagem gelado. Em seguida, centrifugar o tubo a 300 g por cinco minutos à temperatura ambiente. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante, incluindo a camada de EMB.
Em seguida, para cada quatro cúpulas, ressuspenda o pellet em 1 mililitro da enzima TrypLE expressa pré-aquecida. Transfira a mistura para uma placa de 24 poços e incube a 37 graus Celsius sob 5% de dióxido de carbono por 10 minutos. Pipetar suavemente a mistura com uma pipeta de 1 mililitro para quebrar ainda mais os enteróides.
Em seguida, pipetar a mistura com uma pipeta de 200 microlitros para quebrar os fragmentos em células únicas. Use uma seringa de 3 mililitros equipada com uma agulha estéril de calibre 22 para aspirar e dispensar a suspensão celular quatro vezes para obter uma suspensão de célula única. Com um microscópio, monitorar a dissociação celular até que 80% dos enteróides são divididos em células únicas.
Agora colete a suspensão celular em um tubo cônico de 15 mililitros. Adicione quatro volumes de meio de lavagem FBS para apagar a reação. Em seguida, filtre os enteróides através de um filtro de células pré-revestido de 40 micrômetros duas vezes em um tubo cônico de 50 mililitros.
Centrifugar a suspensão a 300 g durante cinco minutos para peletizar as células. Aspirar o sobrenadante para o tubo de centrífuga da suspensão dissociada de células enteróides ileais bovinas. Ressuspender o pellet em um pequeno volume de meio de crescimento organoide.
Em seguida, use o método de exclusão do corante Azul de Tripano e o hemacitômetro para determinar a viabilidade celular. Remova cuidadosamente qualquer solução de revestimento em excesso da inserção de cultura celular. Semeando os 200 microlitros da suspensão de célula única na superfície apical de uma pastilha de cultura pré-revestida.
Agora adicione 700 microlitros de mídia completa FBS ao lado lateral basal da inserção. Mova a placa cerca de 10 vezes na forma do número oito para distribuir uniformemente as células sobre a inserção. Em seguida, coloque a placa no aquecedor de placas no armário de biossegurança por 10 minutos.
Incubar a placa a 37 graus Celsius sob 5% de dióxido de carbono em 48 horas. Após a incubação, substituir os meios dos componentes apicais e basais por meios de crescimento enteróide frescos. No dia seguinte, retirar a média dos compartimentos apicais e basais laterais.
Lave cuidadosamente a pastilha com PBS e substitua-a por meios de diferenciação enteróides, suplementados apenas com inibidores. A formação de enterosfera foi observada poucas horas após o cultivo das criptas bovinas plaqueadas. Após dois dias, o lúmen das esferas estava bem definido, com estruturas brotantes observadas no quarto dia.
Enteróides maduros foram observados até o sétimo dia. A imunomarcação dos enteróides 3D com sete dias de idade mostrou a presença de diferentes linhagens celulares. A proteína E-caderina foi localizada na junção de aderência.
Os enteróides foram positivos para células enteroendócrinas e células Paneth produtoras de lisozima. Monocamadas 2D confluentes foram observadas em menos de uma semana de cultivo.
