Para começar, cubra um prato de micropoço com 150 microlitros de solução de fixação de 0,01% a 0,1% de células antes de incubar. Depois que o prato secar ao ar, adicione 80 microlitros de solução de nanopartículas de ouro sobre a superfície seca. No dia seguinte, remova qualquer meio de cultura adicionado do micropoço.
Em seguida, adicione dois mililitros das células transfectadas sobre as nanopartículas de ouro imobilizadas na superfície de vidro. Incubar a placa antes do início da experimentação. Use um microscópio confocal com um laser de órgão ajustado para 488 nanômetros para visualizar a fluorescência GFP da proteína anexina.
Ajuste o laser de néon de hélio para 633 nanômetros para observar a reflexão das nanopartículas de ouro. Escolha células únicas em vez de aglomerados de células para evitar a sobreposição de membranas plasmáticas. Certifique-se de que as nanopartículas de ouro imobilizadas estejam presentes como partículas únicas e adequadamente espaçadas para evitar o aumento do gradiente térmico.
Use a pinça óptica para irradiar a nanopartícula de ouro por um segundo para romper a membrana plasmática. Para gerar vesículas unilamelares gigantes ou GUV, aplique 90 microlitros de gel de PVA 5% aquecido em uma lâmina de vidro. Espalhe o gel uniformemente sobre a lâmina.
Em seguida, deixe a lâmina secar em um armário de aquecimento a 50 graus Celsius por 50 minutos. Em seguida, use uma seringa de vidro para aplicar 30 microlitros de mistura lipídica. Com a borda da agulha, espalhe a mistura em uma película fina.
Aplique um fluxo suave de gás nitrogênio para evaporar o clorofórmio da mistura lipídica. Em seguida, seque as lâminas sob vácuo por 1,5 a 2 horas. Em um tubo separado de dois mililitros, adicione 400 microlitros de tampão de crescimento.
Em seguida, adicione a proteína recombinante de interesse a uma concentração final de 500 nano molares. Pipetar 400 microlitros da proteína diluída para a câmara interna montada e envolver a câmara em PERIFIL. Após uma hora de incubação, transfira 400 microlitros do conteúdo da câmara para um tubo de dois mililitros.
Adicione um mililitro de tampão de observação na solução recolhida para remover quaisquer proteínas não encapsuladas. Em seguida, centrifugar a solução a 600 G por 10 minutos a 13 graus Celsius. Em seguida, substitua um mililitro do sobrenadante por tampão de observação e pipete suavemente para dispersar os GUVs.
Leve à geladeira até o início da experimentação. Para furar o GUV, primeiro cubra a superfície de um prato de fundo de vidro de 35 milímetros com beta caseína. Em seguida, adicione 5 microlitros de nano cascas de ouro de 150 nanômetros à mistura GUV contendo cloreto de cálcio.
Transfira a mistura para a câmara e monte-a no palco do microscópio. Use a pinça óptica para prender uma nanocasca de ouro individual na superfície GUV. Quando a casca nano aprisionada estiver em contato próximo com a membrana GUV, aumente a potência do laser para perfurar o local alvo.
A irradiação de nanopartículas resultou em uma lesão na membrana e causou rápido recrutamento de anexinas para o local da lesão, após o influxo de cálcio para formar uma estrutura semelhante a um anel. Nos experimentos com GUV, a punção da membrana foi rapidamente selada, na ausência de anexinas. As características biofísicas únicas da proteína anexina A 4 levaram ao rompimento do GUV devido à sua capacidade de rolar membranas.
A presença de anexina nas GUVs causou um rápido acúmulo no local da lesão, após a punção da membrana. A análise dos anéis da anexina A 5 nos experimentos celulares mostrou que eles permaneceram constantes ao longo do tempo e do espaço. A ruptura da membrana plasmática usando termoplasmônica causou níveis elevados de íons cálcio.
As células atingiram uma intensidade máxima de cálcio em 6,6 segundos, um momento que se presume corresponder ao tempo de fechamento da ferida.
