Para começar, pré-aqueça as cabeças de mosquito anofelinos dissecados em tampão CCD a 37 graus Celsius em um bloco de calor por cinco minutos. Transfira o tubo com as cabeças do mosquito para um forno de hibridização para rotação a 37 graus Celsius. Em seguida, transfira todo o conteúdo do tubo para um vidro de relógio dissecante.
Com pinças, pegue as cabeças ou quaisquer antenas destacadas e fixe-as em um mililitro do pré-fixador. Em um nutador, gire as cabeças no pré-fixador por 24 horas a quatro graus Celsius. Para realizar a dissecção do tecido, primeiro, lave as cabeças com um mililitro de PBS-Tween a 0,1% no gelo.
Em seguida, transfira as cabeças para um vidro de relógio dissecante. Sob um microscópio dissecante, remova os tecidos de interesse da cabeça com pinças afiadas. Segure a parte anterior da cabeça com a pinça e pegue uma antena com outra pinça da base.
Da mesma forma, remova os palpos. Transfira as antenas e palpos para tubos vazios livres de DNA/RNA colocados no gelo. Desidratar o tecido em 400 microlitros de reagente desidratante por uma hora à temperatura ambiente.
Em seguida, substitua o reagente desidratante por 400 microlitros de metanol absoluto e desidrate os tecidos durante a noite a menos 20 graus Celsius. Após a fixação completa, reidratar os tecidos em uma série de quatro etapas de soluções de reidratação graduadas por 10 minutos no gelo. Em seguida, lave os lenços em 400 microlitros de PBST por 10 minutos em temperatura ambiente.
Incubar os tecidos em 400 microlitros de solução de proteinase K durante 30 minutos à temperatura ambiente. Lave os tecidos duas vezes em 400 microlitros de PBST para interromper a digestão enzimática. Após a adição do pós-fixador, lavar novamente o tecido com PBST antes da hibridização da sonda.
Submergir o tecido em 400 microlitros de tampão de hibridização por cinco minutos. Em seguida, remova o tampão e pré-hibridize o tecido em 400 microlitros de tampão de hibridização de sonda pré-aquecido por 30 minutos a 37 graus Celsius. Substitua o tampão de hibridização da sonda pré-aquecido por 400 microlitros de solução de sonda aquecida.
Coloque o tubo em um nutador por duas noites a 37 graus Celsius. Em seguida, coloque o nutador dentro de uma incubadora coberta por uma caixa. Em seguida, nutar o tecido em 400 microlitros de tampão de lavagem da sonda a 37 graus Celsius na incubadora.
Após lavar os tecidos em 5x SSCT, incubar em 400 microlitros de tampão amplificador por 10 minutos à temperatura ambiente. Pipetar o tampão de amplificação do tubo. Em seguida, adicione uma mistura dos grampos de cabelo aquecidos, H1 e H2. Em seguida, pipetar 100 microlitros de tampão de amplificação.
Nutar o tecido durante a noite no escuro à temperatura ambiente. Para montar o tecido, primeiro coloque cinco gotas de solução de montagem em uma lâmina de vidro. Em seguida, com pinças, pegue as amostras de tecido lavadas pela base.
Mergulhe e enxágue suavemente na série de gotículas de solução de montagem. Em seguida, monte com a solução de montagem e coloque uma tampa deslizante sobre o tecido. Sele a tampa com esmalte antes de fazer a imagem.
Análises de fichas de HCR do tecido olfatório de fêmeas de mosquitos anopheles revelaram que IR 41t1, IR75d e IR7t foram menos abundantes nas antenas. IR64a foi três vezes mais abundante do que o resto dos genes candidatos. Co-localização das famílias de receptores orco e IR25a foram observadas na antena, bem como no palpo maxilar do mosquito.
Os padrões de co-localização sugerem que as células positivas para IR76b expressam IR25a, enquanto as células positivas para IR8a co-localizam parcialmente com IR76b e IR25a.
