Para começar, em uma placa de seis poços, semeie um mililitro de células 293T de rim embrionário humano. Adicione dois mililitros de DMEM completo. No dia seguinte, substitua o meio por meio fresco livre de antibióticos para preparar as células para a transfecção.
Para transfectar as células aderentes, primeiro, prepare a mistura A adicionando DNA plasmidial a 100 microlitros de Opti-MEM. Em seguida, adicione 17,5 microlitros de polietilenimina a 100 microlitros de Opti-MEM. Misture o conteúdo da mistura A e B e, em seguida, incube.
Durante a incubação, agite suavemente o tubo a cada três a quatro minutos para melhorar a mistura. Adicione todo o volume da mistura à placa com as células HEK 293T. Após 16 a 20 horas da transfecção, substituir o meio de cultura por DMEM completo fresco.
Incubar a placa a 37 graus Celsius sob 5% de dióxido de carbono para produzir os vírus do pseudotipo. Após 72 horas da transfecção, colher o sobrenadante em um tubo de coleta. Centrifugar o sobrenadante a 1, 600 G durante sete minutos à temperatura ambiente.
Em seguida, filtre o sobrenadante através de um filtro de acetato de celulose de 0,45 micrômetros. Distribuir 50 microlitros de DMEM completo nos poços de uma placa de 96 poços. Deixe a linha A vazia.
Adicionar 100 microlitros do estoque de pseudovírus aos poços da linha A.Em seguida, pipetar 50 microlitros da solução da linha A para B.Repita este processo até a linha G para obter diluições seriais. Remova o meio exaurido de uma placa com células HEK 293T ACE2 suscetíveis cultivadas e lave as células com quatro mililitros de DPBS. Em seguida, desprenda as células com um mililitro de EDTA de tripsina em solução salina DPBS.
Agora adicione 50 microlitros da suspensão de células suscetíveis em cada poço contendo os vírus do pseudotipo. Incubar a placa a 37 graus Celsius sob 5% de dióxido de carbono por 48 horas. Adicione 100 microlitros do reagente luciferase a cada poço.
Após a incubação, transfira o conteúdo de cada poço para uma placa preta de 96 poços. Em seguida, leia a placa em um leitor de placas. Em uma placa de 96 poços, adicione 50 microlitros de DMEM completo fresco às colunas um a 10 das linhas B a H.Adicione 95 microlitros de DMEM completo fresco aos poços correspondentes da linha A.Agora adicione 50 microlitros de DMEM completo aos poços na coluna 11 e 100 microlitros de DMEM à coluna 12.
Pipetar cinco microlitros de amostras de soro inativado termicamente para a linha A.Com uma pipeta multicanal, misturar as amostras na primeira fileira e transferir 50 microlitros de soro contendo meio da linha A para B até a linha H.Distribuir 50 microlitros de meio contendo pseudovírus diluído para cada poço das colunas um a 11. Incubar a placa a 37 graus Celsius a 5% de dióxido de carbono durante uma hora. Preparar uma suspensão de células ACE2 suscetíveis HEK293T em cinco mililitros.
Adicione 50 microlitros da suspensão celular a cada poço e, em seguida, incube antes de realizar o ensaio de luciferase. A menor diluição do soro resultou na diminuição da entrada viral nas células. Isso é confirmado pelo aumento da porcentagem de neutralização.
