Para começar, encha cada agulha com cinco microlitros de solução de nanocorpo GFP marcada com flúor Alexa. Coloque uma tampa de 25 por 25 milímetros sobre uma superfície de lâmina de vidro. Pipetar 40 microlitros de óleo de Halocarbon na lâmina e espalhá-lo ao longo do perímetro da tampa.
Sob o microscópio de injeção, posicione a ponta da agulha contra a borda da tampa submersa em óleo. Ajuste a pressão do ar de injeção da PicoPump em conformidade. Substitua a lâmina de vidro vazia pela lâmina de embrião de Drosophila preparada.
Ajuste a ponta da agulha de injeção perpendicularmente ao eixo anteroposterior do embrião. Use o manipulador de estágio XY para guiar os embriões em direção à agulha até que a ponta atinja o centro da gema e bombeie de duas a três vezes para infundir anticorpos na gema. Com o manipulador de estágio XY, afaste os embriões da agulha após a injeção e passe para o próximo embrião.
Permitir que os embriões incubem a 25 graus Celsius até atingir o estágio de desenvolvimento desejado. Após a incubação, identifique os embriões sob uma lente de baixa potência com iluminação de campo brilhante e mude para uma lente de 40X ou 63X para imagens ao vivo fluorescentes de alta resolução. Após a injeção, a relação sinal-ruído do receptor do entalhe melhora significativamente comparável à qualidade do sinal da imunofluorescência.
Além disso, a injeção de anticorpos permitiu a caracterização temporal da localização da incisura em intervalos de 45 segundos sem perda aparente da intensidade do sinal em uma janela de imagem de cinco minutos. Imagens ao vivo de fosfotirosina embrionária mostraram que a fosforilação da tirosina é altamente enriquecida nas junções tricelulares. Além disso, uma nova segunda população de sinal de fosfotirosina foi observada abaixo do centro da membrana apical.
A imagem em duas cores revelou que essa população de sinal de fosfotirosina é próxima à miosina medial. Além disso, a população medial de fosfotirosina exibiu padrões de coalescência e dissipação pulsáteis semelhantes, como mostrado para miosina medial.
