Para realizar o plaqueamento organoide, primeiro, remova o sobrenadante da centrífuga e lave as células do carcinoma hepatocelular. Ressuspender as células nos 50 microlitros de extrato da membrana basal, ou BME, por poço, para plaqueamento. Em seguida, suspenda as células em DMEM/F12 avançado.
Em seguida, pipetar suavemente os agregados da célula até que uma suspensão uniforme seja vista. Adicione BME à suspensão, garantindo que a concentração de BME esteja entre 30 e 50%Agora semeia 50 microlitros de gotículas de BME com aglomerados de células no centro de uma placa de 24 poços. Deixe as gotículas solidificarem a 37 graus Celsius por 20 minutos.
Adicione 500 microlitros de meio pré-aquecido a cada poço e incube em uma incubadora de células a 37 graus Celsius. Atualize o meio de cultura a cada dois ou três dias. Após duas semanas, substituir o meio de isolamento pelo meio de expansão organoide.
Após sete a 10 dias de cultivo, uma vez que os organoides tenham atingido a densidade adequada, processar as culturas conforme necessário. Para passar os organoides, primeiro pré-aqueça placas de cultura de células de superfície de ultra baixa fixação em uma incubadora. Em seguida, descongele o BME congelado durante a noite a quatro graus Celsius até pouco antes do uso.
Pré-aqueça a solução de colheita organoide e o substituto de tripsina a 37 graus Celsius por 30 minutos. Após a etapa de preparação, remova o meio de cultura da placa de cultura organoide. Em seguida, transfira a suspensão organoide para um tubo de 15 mililitros.
Agora adicione a solução de colheita de organoides na proporção da quantidade de BME. Para misturar a suspensão, use uma pistola de pipeta de 1000 microlitros para raspar e pipetar para cima e para baixo. Depois de incubar o tubo à temperatura ambiente por 30 minutos, use uma pipeta de um mililitro para aspirar cuidadosamente a EMB.
Certifique-se de que o BME está totalmente dissolvido. Monitore o extrato a cada 10 minutos até que um aglomerado claro de células organoides seja visível. Em seguida, centrifugar à temperatura ambiente a 400 g por cinco minutos.
Remova o máximo possível do sobrenadante. Para iniciar a digestão enzimática dos organoides do carcinoma hepatocelular, adicione um a cinco mililitros do substituto de tripsina pré-aquecido à pastilha organoide cultivada. Incubar a suspensão a 37 graus Celsius durante dois minutos.
Use um microscópio para verificar se os organoides se dissociam em pequenos aglomerados de duas a 10 células. Para interromper a digestão, adicione um volume apropriado de meio basal frio. Em seguida, centrifugar os organoides a 400 g por cinco minutos a oito graus Celsius.
Remova cuidadosamente o máximo de sobrenadante possível. Ressuspenda o número desejado de organoides na matriz adequada para plaqueamento. A cada 10 dias passam os organoides, dependendo da densidade de crescimento dos organoides.
Esferoides organoides de CHC foram observados dentro de três dias de cultura. Esferoides compactos com bordas arredondadas e citosol permeável foram vistos no dia inicial de estabelecimento. Os organoides foram de tamanho semelhante e apresentaram o maior diâmetro quando cultivados em 30 a 50% de EMB.
A EMB foi mais fragmentada em 10%, resultando nos menores organoides. A EMB estava mais intacta a 100%, mas resultou em organoides com diâmetro intermediário. O organoide de CHC em proliferação atingiu um tamanho superior a 500 micrômetros em cada cultura após três gerações.
Organoides de CHC de tamanho substancial superior a 1000 micrômetros foram obtidos dentro de um período de cultura de 20 dias.
