Para começar, adicione oito mililitros de DPBS em um tubo cônico estéril de 50 mililitros. Para isso, adicione oito mililitros de sangue e use uma pipeta plástica Pasteur de três mililitros para misturar bem o conteúdo. Adicione 15 mililitros de meio de isolamento de linfócitos em outro tubo cônico.
Incline o tubo em 20 a 30 graus. Em seguida, use uma pipeta Pasteur de três mililitros para aplicar a primeira camada da mistura de DPBS de sangue suavemente sobre o meio de isolamento. Coloque a mistura restante cuidadosamente sobre a parede lateral do tubo.
Lentamente, coloque o tubo em uma posição vertical para colocar o sangue restante na camada sanguínea. Centrifugar o tubo a 1000G por 10 minutos à temperatura ambiente em uma caçamba oscilante com os freios desligados. A mistura de PBMC de sangue será separada em quatro camadas distintas.
Com uma pipeta Pasteur, remova dois terços da camada de plasma e, em seguida, use uma pipeta de um mililitro para coletar os PBMCs. Transfira os PBMCs para um novo tubo de 50 mililitros até que toda a camada tenha sido colhida. Em seguida, faça o volume de até 25 mililitros com DPBS para remover o meio de isolamento residual e outros resíduos.
Centrifugar o tubo a 100G por 10 minutos à temperatura ambiente com os freios ligados. Em seguida, remova o sobrenadante com uma bomba de vácuo. Em seguida, ressuspenda o pellet em um mililitro DPBS e adicione mais DPBS para compensar o volume de 25 mililitros para lavar e ressuspender o pellet.
Resfriar um recipiente de congelamento a quatro graus Celsius. Em seguida, coloque soro fetal bovino no gelo. Ressuspender o pellet celular contendo as CMSP isoladas em um mililitro de soro fetal bovino.
Em seguida, DMSO misto com soro resfriado no gelo na proporção de um para cinco. Transfira a suspensão celular para criotubos marcados com dois mililitros, utilizando um tubo por tubo de coleta. Com um contador de células automatizado, determine a contagem de células e a viabilidade.
Use uma pipeta de um mililitro para soltar um mililitro da mistura de DMSOFBS no tubo. Em seguida, coloque os tubos no recipiente de congelamento pré-resfriado. Coloque o recipiente em um freezer a 80 graus Celsius negativos por 24 horas.
No dia seguinte, retire os tubos do freezer e guarde-os na fase gasosa de nitrogênio líquido. A contagem e a viabilidade celular foram consistentes antes e após a criopreservação, indicando sucesso no isolamento e preservação.
