Para começar, ajuste os parâmetros da estação de pipeta colocada na capela de fluxo laminar para 1.900 volts, 20 milissegundos em um pulso. Retire cuidadosamente um tubo de transfecção da embalagem para mantê-lo estéril e preencha-o com três mililitros de tampão E. Para preparar as células para eletroporação, remova o meio de crescimento das células e lave-as com PBS para remover o soro e cátions divalentes que promovem a adesão.
Em seguida, adicione uma mistura de PBS e um EDTA milimolar às células e incube à temperatura ambiente por cerca de cinco minutos até que as células comecem a se desprender. Pipetar para cima e para baixo suavemente para separar as células e transferir as células para um tubo de 15 mililitros de baixa ligação à proteína. Pelotar as células a 500 G por cinco minutos.
Após a centrifugação, remova rapidamente a maior parte do sobrenadante, deixando cerca de um mililitro do sobrenadante no tubo. Ressuspenda as células no sobrenadante restante e transfira-as para um tubo de microfuge de 1,5 mililitro de baixa ligação à proteína. Remover uma pequena alíquota de células para contar e peletizar as células restantes por centrifusão a 500 G à temperatura ambiente por cinco minutos.
Conte as células durante a centrifugação. Tome 1x sgRNA em solução de Cas9 de 20 milimolares e aqueça os tubos à temperatura ambiente. Após a centrifugação, remova todo o sobrenadante do pellet celular e ressuspenda as células em PBS com cloreto de cálcio e cloreto de magnésio a uma concentração de 40 milhões de células por mililitro.
Para a montagem do complexo ribonucleoproteína Cas9 sgRNA, adicione 2,5 microlitros de sgRNA a um microlitro do Cas9 diluído em tubos de PCR esterilizados e dispense o sgRNA lentamente com mistura por cerca de 15 segundos para evitar precipitação. Incubar durante cinco minutos à temperatura ambiente para permitir a formação do complexo ribonucleoproteico. Para entregar o complexo ribonucleoproteico por eletroporação, prepare a ponta de eletroporação pressionando o êmbolo para estender a haste.
Em seguida, insira a haste na ponta. Ressuspenda as células pipetando para cima e para baixo. Carregue a ponta de eletroporação com as células e retire toda a capacidade volumétrica de 10 microlitros da ponteira.
A partir do controle negativo sgRNA, transferir 10 microlitros de células na ponta de eletroporação para o tubo de amostra contendo 3,5 microlitros de ribonucleoproteína. Pipetar para cima e para baixo três vezes para misturar bem e retirar 10 microlitros da mistura de volta para a ponta. Coloque a ponta na estação de eletroporação, abaixando-a no buffer e pressione Start na tela sensível ao toque.
Após a conclusão, o visor indicará um pulso bem-sucedido. Retire a pipeta do dispositivo e coloque as células em um poço seco da placa de 12 poços não revestida. Enxágue a ponta pipetando para cima e para baixo duas vezes em 15 mililitros de PBS com cloreto de cálcio e cloreto de magnésio.
Separe a pipeta com a ponta ainda presa. Adicione imediatamente um mililitro do meio livre de antibióticos aliquotado anteriormente às células e agite suavemente o prato para misturar. O cromatograma representativo de sequenciamento de Sanger do locus Rosa 26 dos macrófagos derivados da medula óssea eletroporados com uma ribonucleoproteína Cas9 de sgRNA não direcionada controlada, sgRNA específico de Rosa 26 e genes Src e Cblb nos macrófagos editados são mostrados aqui.
A análise dos genes alvo por PCR e sequenciamento de Sanger mostra múltiplos nucleotídeos em cada posição a jusante do sítio de clivagem Cas9. Estes resultados validam a obtenção de uma alta eficiência de edição para múltiplos genes-alvo.
