Para começar, coloque tampas de vidro de 25 milímetros nos poços de uma placa de cultura de células de seis poços. Coloque uma gota de polilisina no centro de cada lamínula. Após a incubação, lave cada tampa três vezes com água destilada.
Em seguida, lave as escorregas da tampa duas vezes com uma solução salina isenta de cálcio. Em seguida, instale as tampas em uma câmara de gravação e preencha-a com soro fisiológico isento de cálcio. Coletar as larvas errantes de terceiro ínstar do cruzamento genético desejado de drosófila.
Transfira as larvas para um poço de prato e, em seguida, lave as larvas três vezes com água destilada. Coloque as larvas em outra placa de dissecção de vidro contendo 750 microlitros de solução salina gelada e sem cálcio. Agora coloque uma larva sob um microscópio estéreo.
Com um par de pinças, faça um corte transversal na parte de trás do abdômen. Empurre a mandíbula com a pinça para virar as larvas do avesso. Observe o cordão nervoso ventral próximo à mandíbula.
Remova cuidadosamente os discos imaginários e os tecidos cerebrais remanescentes. Em seguida, separe o cordão nervoso ventral com o cérebro central e os lobos ópticos do resto do tecido. Transfira o cordão nervoso ventral para a câmara de registro contendo solução salina livre de cálcio.
Para evitar interferências, prenda os nervos restantes ao fundo da tampa com pinças. Para realizar experimentos em corpos gordurosos, proceda ao isolamento dos tecidos adiposos da larva transformada. Coloque os corpos gordurosos isolados expressando os sensores de traste na câmara de registro.
Para adquirir imagens de tecidos expressando sensores, ligue o sistema de iluminação do microscópio. Coloque a câmara de gravação contendo cordões nervosos ventrais ou corpos de gordura no palco de um microscópio fluorescente. Para visualizar a fluorescência GCaMP6f, defina o comprimento de onda de excitação para 488 nanômetros.
Para metabólitos como sensores lacônicos, pirônicos, ATP ou de glicose, defina a excitação para 440 nanômetros. Agora defina a aquisição de imagem em intervalos regulares para GCaMP6f e sensor de metabólito. Coloque a objetiva de imersão em água, garantindo que ela permaneça submersa.
Em seguida, conecte a câmara de gravação a um sistema de perfusão. Use uma bomba peristáltica de baixo fluxo para extrair o líquido da câmara e manter um fluxo constante de três mililitros por minuto. Posicionar a solução contendo tubos 25 centímetros acima do estágio do microscópio.
Antes de qualquer estimulação, obtenha uma linha de base de fluorescência estável, permitindo que a solução de gravação flua por cinco a 10 minutos. Agora, substitua a solução de fluxo pela solução de estimulação contendo glicose, piruvato ou lactato por cinco minutos. Capturar as imagens do cordão nervoso ventral estimulado que foi exposto à picrotoxina de 80 micromolares para avaliar a atividade neuronal.
Sensores lacônicos em células gliais e neurônios motores respondem a um lactato milimolar em uma taxa semelhante no início do pulso. No entanto, os neurônios motores atingem um aumento maior em relação à linha de base durante o pulso de cinco minutos. O sinal do sensor de glicose aumentou a uma taxa semelhante nas células gliais e neurônios quando expostos à glicose de cinco milimolares.
Durante o pulso de glicose, no entanto, o sinal nos neurônios aumenta mais do que nas células gliais. Nocautear o transportador Chaski reduziu o transporte de lactato nas células gliais. Aumentos induzidos por picrotoxinas na atividade neuronal resultaram em uma queda transitória nos níveis de ATP no soma dos neurônios motores.
Observou-se que o sensor lacônico está bem expresso nos corpos gordurosos. O aumento da fluorescência dos sensores de glicose foi observado quando os corpos gordurosos foram expostos ao aumento da concentração de glicose. O aumento das concentrações de lactato e piruvato resultou em aumento proporcional da fluorescência lacônica e pirônica.
