Antes da passagem celular. revestir uma placa de seis poços com solução de revestimento a frio e incubar a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por uma hora, aspirar o meio de células-tronco da placa de seis poços contendo células-tronco pluripotentes humanas e adicionar um mililitro de DPBS livre de cálcio e magnésio em cada poço. Após a segunda lavagem, adicionar 500 microlitros de solução de dissociação em cada poço e incubar por dois a cinco minutos à temperatura ambiente.
Enquanto isso, aspirar a solução de revestimento da placa de seis poços e adicionar um mililitro de DPBS sem cálcio e magnésio em cada poço. Sob microscópio invertido, observe o processo de dissociação celular. Quando 80 a 90% das células parecerem arredondadas e aderentes, aspirar a solução de dissociação dos poços da placa de seis poços.
Em seguida, adicione um mililitro de meio de células-tronco contendo 10 inibidores de rocha micromolar na placa de seis poços. Adicione 10 microlitros de suspensão de células dissociadas em um tubo. Em seguida, adicione um volume igual de azul de tripano.
Misture suavemente e conte as células usando um hemocitômetro. Após a contagem celular, adicionar dois mililitros de meio de células-tronco por poço contendo 0,8 a 1 vezes 10 às 6ª células por mililitro e 10 inibidor de rocha micromolar. Mova rapidamente a placa para frente e para trás, de um lado para o outro, três vezes.
Coloque a placa em uma incubadora de 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono. Mova rapidamente a placa para frente e para trás e de um lado para o outro 10 vezes antes de incubar por duas horas. Descongelar o meio basal para os dias zero e quatro e suplementos no gelo.
Aqueça dois mililitros por dia um meio e lave um em banho-maria de 37 graus Celsius por cinco minutos. Em seguida, aspirar o meio de células-tronco dos poços de uma placa de seis poços e adicionar dois mililitros de meio de lavagem um. Depois de aspirar o meio de lavagem um, adicione imediatamente dois mililitros do meio do dia um ao lado do poço.
Incubar as células a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono durante 24 horas. No 12º dia do processo de diferenciação, tratar uma placa de seis poços contendo micropoços de 400 micrômetros com dois mililitros de Solução de Enxágue Antiaderente. Sob um microscópio invertido, observe a placa em busca de bolhas.
Se não forem observadas bolhas, aspirar a Solução de Enxágue Antiaderente e adicionar imediatamente dois mililitros de meio de lavagem dois. Em seguida, aspirar o meio progenitor pancreático e adicionar 0,5 mililitros de tampão de dissociação por poço. Incubar as células à temperatura ambiente durante dois a cinco minutos.
Quando a maioria das células estiver arredondada e ainda aderente, aspirar o tampão de dissociação e adicionar imediatamente um mililitro de meio de aglomerado quente a cada poço. Usando uma ponta de pipeta P1000, dissociar as células suavemente, pipetando para cima e para baixo enquanto alternadamente usando um movimento circular e movendo-se de cima para baixo do poço para separar as células uniformemente em todo o poço. Transfira a mistura de células dissociadas para um tubo cônico de 50 mililitros.
Adicione um mililitro do meio de agrupamento na placa de seis poços para coletar todas as células restantes. Em seguida, aspirar o meio de lavagem dois da placa de seis poços do micropoço e adicionar suspensão de células dissociadas. Incubar as células a 37 graus Celsius por 24 horas.
No dia seguinte, usando uma ponta de pipeta P1000, colete lentamente os cachos da placa de seis poços do micropoço em um tubo cônico de 50 mililitros. Adicione um mililitro do meio do dia 13 para coletar os cachos restantes e transferir os cachos para o tubo. Deixe que as células se coloquem naturalmente sob gravidade no fundo do tubo por cinco minutos.
Aspirar cuidadosamente o sobrenadante do tubo sem perturbar os aglomerados celulares. Em seguida, adicione dois mililitros de meio dia 13 no tubo. Misture suavemente pipetando para cima e para baixo, evitando a aspiração de cachos.
Transfira a suspensão para uma placa de seis poços de baixa aderência. Mova rapidamente a placa para frente e para trás, de um lado para o outro, seis vezes. Incubar as células a 37 graus Celsius por 48 horas.
Imagens de imunofluorescência dos agrupamentos mostraram predomínio de células produtoras de insulina co-expressando os marcadores de células beta pancreáticas. A expressão de genes de assinatura de células beta revelou aproximadamente 25% de células expressando Nkx6.1 e 40% expressando Pdx1. Durante o ensaio de secreção de insulina estimulada por glicose, os clusters derivados do MEL1 secretaram níveis significativamente mais altos de insulina em resposta a altas concentrações de glicose em comparação com baixas concentrações de glicose.
