Para começar, use uma pipeta multicanal para pipetar 100 microlitros de cisteína 10 milimolar nos poços de uma placa de 96 poços em uma coifa estéril. Depois de incubar a placa, aspire cuidadosamente a solução do poço e evite arranhar o eletrodo. Enxágue os poços duas vezes com água deionizada estéril.
Em seguida, adicione 100 microlitros de colágeno de cauda de rato recém-preparado, uma solução em cada poço. Bem, incube a placa por uma hora sob pouca luz antes de lavar duas vezes com água deionizada. Em seguida, transfira as células endoteliais cerebrais colhidas para uma calha estéril fresca.
Com uma pipeta multicanal, adicione 100 microlitros da suspensão celular em cada poço completando a semeadura em 30 segundos, mantenha um meio de poço apenas para fins de modelagem matemática. Em um adaptador de placa de 96 poços, mova os clipes vermelhos de cada lado para fora para permitir que a placa seja inserida. Precisamente, alinhe o poço A um da placa com a região A um do adaptador e aplique uma leve pressão na parte superior da placa para mantê-la firmemente no lugar.
Em seguida, trave os clipes vermelhos de volta. Pressione configurar para iniciar o instrumento após fechar a incubadora, todos os poços detectados corretamente serão indicados por uma cor verde no mapa da placa. Pressione o botão de verificação para autenticar as leituras de impedância absoluta.
Agora use o menu suspenso abaixo do mapa de placas para selecionar o tipo de placa que está sendo usada para o experimento. Selecione multifrequência para medir a impedância em várias frequências de corrente alternada. Por fim, clique no botão Iniciar para iniciar o experimento.
Permitir a proliferação das células até à formação de uma monocamada de elevada resistência, indicada por um aumento de ohms. Certifique-se de que o crescimento celular atingiu um platô antes de preparar as soluções de tratamento. Para preparar soluções de tratamento, coloque tubos de polipropileno de 1,1 mililitro rotulados em placas de tubo de tira.
Adicione três 50 microlitros das citocinas ou células de tratamento no tubo seguindo um mapa de placas pré-fabricado. Em seguida, coloque-os na incubadora para se aquecer. No software EISs.
Clique em pausar para interromper temporariamente o experimento em andamento. Quando solicitado, abra a incubadora e solte cuidadosamente os dois clipes vermelhos enquanto segura a placa com firmeza. Com o experimento ainda em estado pausado, transfira a placa para o exaustor estéril.
Em seguida, remova os tubos descascados de tratamento da incubadora. Com uma pipeta multicanal. Ressuspenda cuidadosamente o conteúdo dos tubos descascados de tratamento.
Agora pipete 100 microlitros de tratamento dos tubos descascados e transfira-os para os poços apropriados na placa de 96 poços, adicione apenas meios completos aos poços livres de células. Tente terminar a pipetagem em menos de cinco minutos, pois o resfriamento excessivo da placa pode afetar a resistência da monocamada de células endoteliais. Recoloque a placa tratada na máquina e verifique a impedância do eletrodo bem.
Confirme se as configurações corretas de aquisição de multifrequência e o catálogo de placas foram selecionados. Em seguida, pressione retomar para continuar o experimento. Depois que o experimento progredir para o ponto de extremidade desejado, pressione concluir para salvar automaticamente o arquivo gravado.
Navegue até o arquivo e clique em exportar dados para exportar os dados como um arquivo XLS ou CSV para análise posterior. O aumento da resistência foi observado ao longo de 30 horas, indicando a fase de crescimento das células endoteliais. Durante a fase de crescimento, as células se estabilizaram em diferentes níveis em 48 horas, a normalização da medição permitiu uma interpretação mais confiável das mudanças de resistência.
A contagem incorreta de células do endotélio cerebral antes do tratamento resultou em uma fase de crescimento flutuante, que gradualmente diminuiu em um platô de resistência estável. A densidade de semeadura celular otimizada e o volume de carga resultaram em uma fase de crescimento ideal. As citocinas pareciam ter um efeito transitório na barreira.
A adição de células de melanoma reduziu drasticamente a resistência da barreira. A barreira paracelular e o componente basolateral flutuaram com a adição das citocinas, a adição de células de melanoma resultou em uma maior magnitude de diminuição da barreira paracelular em relação ao componente basolateral.
