Para começar, no exaustor estéril, aparafuse potes de autoclave de 24 poços no módulo de célula esterilizada por etanol. Adicione 900 microlitros de mídia base em cada pote. Agora conecte os eletrodos de imersão da autoclave magneticamente à tampa do módulo da célula.
Em seguida, feche a tampa sobre os poços para que os eletrodos de imersão se encaixem nos potes de eletrodos inferiores. Em seguida, conecte o módulo de célula ao adaptador em uma incubadora. Em seguida, inicie o software e clique na guia de layout para carregar e anotar o mapa experimental da placa.
Use uma placa de cultura estéril de 24 poços para segurar as inserções da membrana. Onde o revestimento for necessário, adicione solução de matriz extracelular à interseção do poço Com uma pipeta de canal único, semeie cuidadosamente as células endoteliais cerebrais na câmara apical de cada inserção do poço. Para criar um poço livre de células, pipete apenas meios completos em um dos insertos.
Em seguida, transfira o módulo celular da incubadora para uma coifa estéril. Usando uma pinça, transfira cuidadosamente as inserções preparadas para os potes de eletrodos. Coloque o módulo de célula de volta na incubadora sobre o adaptador.
Em seguida, localize a seção de espectro na guia de controle do experimento e selecione Iniciar em um hertz e parar em 100 kilohertz para adquirir dados em toda a faixa de frequência. Em seguida, no tempo de espera, selecione 15 minutos para permitir medições contínuas na taxa mais rápida. Pressione iniciar para iniciar a coleta de dados.
Após aproximadamente 48 horas, uma vez atingido um platô na resistência endotelial, coloque os tratamentos preparados em uma incubadora para manter uma temperatura ideal. Remova o módulo celular em um tempo de tratamento selecionado que começa imediatamente após uma medição de 15 minutos. Em um capô estéril, abra o módulo de célula.
Em seguida, pipete cuidadosamente 70 microlitros do tratamento na câmara apical do respectivo inserto. Retorne imediatamente o módulo da célula ao adaptador antes do início da próxima medição. Para encerrar o experimento, pressione o botão Parar, clique em arquivo, seguido de exportar para exportar os dados diretamente para um arquivo XLS e nomeie-o adequadamente.
Embora tenha sido observada alguma variação entre os poços replicados, a normalização dos dados reduziu essa variação e permitiu uma melhor comparação do tratamento com o controle. Uma diminuição transitória na resistência elétrica transendotelial foi observada quando as citocinas foram adicionadas. As linhagens celulares de melanoma causaram uma diminuição substancial da resistência em cinco horas.
