Para começar, use os primers específicos 515f e 806r para amplificar a região hipervariável V4 do gene 16S rNA. Realizar PCR usando as condições dadas. Em seguida, adicione 3,5 microlitros de tampão de sequenciamento e 1,5 microlitros de mistura enzimática ao tubo.
Depois de misturar e girar a amostra, configure uma reação termocicladora. Agora, adicione a mistura de ligadura do adaptador no tubo e incube a 20 graus Celsius por 15 minutos em um termociclador. Adicione 1,5 microlitros de enzima reagente de extensão específica de uracila à mistura de ligadura e incube a 37 graus Celsius por 15 minutos.
Agora, adicione 43,5 microlitros de esferas magnéticas ao DNA de ligadura do adaptador e misture 20 vezes. Após cinco minutos, coloque o tubo em um rack magnético por cinco a 10 minutos para separação do talão e descarte o sobrenadante. Lave o pellet com 100 microlitros de etanol 80% e seque as contas por 30 segundos.
Para eluir as contas em pellet, adicione 8,5 microlitros de 10 milimolares Tris HCl no tubo e incube por dois minutos. Coloque o tubo em um rack magnético e remova 7,5 microlitros de DNA escapado como sobrenadante em um novo tubo. Adicione reagentes de PCR ao tubo contendo DNA ligado ao adaptador para configurar uma reação de 25 microlitros.
Para limpar o DNA amplificado, adicione 22,5 microlitros de contas magnéticas no tubo e misture 20 vezes. Após cinco minutos, retire 50 microlitros de sobrenadante e lave as contas com 100 microlitros de etanol 80%. Ressuspenda as contas castanhas escuras em 16 microlitros de água e misture 20 vezes.
Coloque o tubo no rack magnético por 30 a 60 segundos e transfira 15 microlitros para um tubo novo. Misture 90 microlitros de tampão, um microlitro de corante e dois microlitros de amostra de biblioteca de DNA e leia a concentração de DNA em um fluorímetro. Após diluir o DNA em dois nanomolares, carregue de 27 a 30 microlitros da célula de fluxo e coloque-a no sequenciador.
Salve os arquivos FASTQ obtidos do sequenciador. Clique para abrir um arquivo de planilha e criar um arquivo de mapeamento ou metadados. Abra o site da Nephele, carregue os arquivos FASTQ e leia QC End QIIME2, Perform Filtering and Trimming.
Em seguida, usando DADA2, execute leituras de extremidade emparelhada depaltada desmultiplexada, substituição de filtro, erros de quimera e mesclagem. Use o classificador Naive Bayes treinado na unidade taxonômica operacional de 99% da versão 132 de Silva, ou banco de dados OTU, para realizar a atribuição taxonômica bacteriana com 97% de similaridade. Abra o site do MicrobiomeDB.
Clique para carregar os arquivos e gerar diversidade alfa OTU, diversidade beta, abundância relativa e curvas de rarefação. Finalmente, abra uma planilha e transfira dados para fazer mapas de calor, diagramas de Venn e tamanho de efeito de análise discriminante linear. Um mapa de calor baseado na abundância relativa de bactérias em diferentes estágios da vinificação mostrou a dominância de filos como Proteobacteria, Actinobacteriota, Firmicutes, Bacteroidota e Fusobacteriota.
Em nível de gênero, gêneros importantes como Enterobacteriaceae e Lactobacillaceae foram identificados. Uma análise do diagrama de Venn revelou 15 OTUs únicas compartilhadas desde o mosto de uva até o vinho final. Os resultados do sequenciamento do amplicon com base na região da variável V4 também indicaram que a diversidade alfa nas duas análises de diversidade R e L. Beta mostrou uma mudança nas bactérias durante a fermentação, mas a composição bacteriana no vinho final foi semelhante àquela nos estágios de adição de mosto e levedura.
